进化树专题（九）| 从DNA序列到分化时间——如何构建带分歧时间的进化树？
分化时间是当前宏观进化分析的一个热点，以某一个或某几个特定类群的化石时间作为参照，通过基因序列间的分歧程度以及分子钟来估计分支间的分歧时间，同时计算系统发育树上其它节点的发生时间，从而推断相关类群的起源和不同类群的分歧时间。
根据分子钟理论，基因序列中密码子随着时间的推移以几乎恒定的比例相互替换，即具有恒定的演化速率，两个物种之间的遗传距离将与物种的分化时间成正比。我们通常采用单拷贝基因家族中的四重简并位点来估算分子钟（替换速率）以及物种间的分化时间，密码子中的四重简并位点由于第三碱基不改变所编码的氨基酸，属于中性进化，其中中性替换速率一般用每个位点每年的变异数来衡量。
利用贝叶斯统计或其他方法估计物种分歧时间的程序很多，如R8S、MCMCTREE、MULTIDIVTIME、BEAST等，通过不同的策略将化石时间信息整合到一个系统发育树中，从而计算得到Divergence time Tree。
下面我们对构建Divergence time Tree的方法和步骤做一个简述：
利用单拷贝基因的CDS或PEP序列构建系统发育树，推荐PhyML或Mrbayes 。因为ML树和贝叶斯进化树对核苷酸 / 氨基酸替代模型的选择非常敏感，故在进行进化树或分化时间构建之前，需对核苷酸 / 氨基酸替代模型进行选择（进化树专题（四）| 进化模型选择的那些事儿 ）。
构建获得 newick格式的进化树，如下例子：
那如何查两两物种间的化石分化时间？
通过网站http://www.timetree.org/ ，该网站根据多篇文献支持提供两两物种间的分化时间，并给出置信度范围，单位是Mya(million years ago)。另外一个可以查询分化时间的网站是https://fossilcalibrations.org/ ，可以互相参考。
在已经构建好的树中添加化石时间，主要形式是 '>0.22<6.75'，'>'后接分化时间的最小值，'<'后接最大值，如下实例：
当样本比较多时，要考虑不同距离的节点，只有一个节点估算的可能不准确，可以提供三到五个的节点（物种）的分化时间。
这里主要介绍3种程序：
1. 使用 r8s（https://sourceforge.net/projects/r8s/）估计分歧时间，速度很快，一般时间<10min
准备配置文件r8s.ctl：
运行程序：
2. 使用 multidivtime（https://brcwebportal.cos.ncsu.edu/thorne/multidivtime.html） 估计分歧时间，时间~5hours
-> 先利用PAML baseml估计分支的核苷酸频率、转换/颠换率等参数
-> 再利用paml2modelinf将baseml输出文件转换为estbranches输入文件
-> 利用estbranche对树分支长度进行最大似然率估计
输入文件是前一步的输出结果
-> 运行multidivtime进行分歧时间估计
利用前一步的输出，准备配置文件divtime.ctl，运行程序
3. 使用 PAML mcmctree（http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html） 估计分歧时间，强烈推荐，时间~20hours
准备配置文件 mcmctree.ctl
运行程序：
计算完成后，就获得了带分歧时间的进化树了~~
当然这只是最基本的例子，后续可以对进化树进行一系列美化操作。整个过程还需要自己操作一遍，毕竟实践出真知~~~
[参考资料]：
https://brcwebportal.cos.ncsu.edu/thorne/multidivtime.html
http://abacus.gene.ucl.ac.uk/divtimes/index.html
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