干细胞的下一个风口，或许是干细胞外泌体

撰文｜王汉裕（笔名：东海先生）

编辑｜南风

校对｜西西

来源｜医学参考报

前言 /               

外泌体可能是细胞治疗发挥作用的重要媒介。也不知道是从今年何时起，受到了大大小小的细胞公司和行业媒体的密切关注。昨天在干细胞继教班的课堂上，西比曼生物科技集团再生医学事业部的戴老师的讲解非常精彩（不过小编有事开了个小差木有听到😪）。为补遗憾，本条推文小编力荐东海先生的力作以飨读者，顺道自己也解解馋。

外泌体是一种胞外囊泡

2013年，诺贝尔生理学或医学奖授予了三位科学家，表彰其在细胞间囊泡运输调控机制领域作出突出贡献。诺奖的肯定，使得细胞分泌的胞外囊泡及其生理学功能成为热点，得到广泛的研究。

不同类型的细胞均可以通过脱牙方式释放各种各样的膜包裹的囊泡（如外泌体、微囊泡、凋亡小体）到它们的细胞外环境中，大小从大约40 纳米到几毫米不等。这些分泌的囊泡统称为胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV），或称为微囊泡（microvesicles）[1]。EV的外膜为磷脂膜，包含特定细胞类型的蛋白质组合，包括酶、生长因子、受体和细胞因子以及脂质、编码和非编码RNA和代谢物^{[1, 2]}。直径约为40-150nm的胞外囊泡，即为外泌体（exosome）。

早在20世纪60年代，EV的生理功能得到阐述，EV在细胞、器官之间，甚至在有机体之间传递信息，并在体液中检测到，如血液、尿液、脑脊液、母乳和唾液^[3]。由于其稳定的脂质双层膜结构和在生物液中的运输能力，EV可以在细胞之间运输和转移生物活性分子，如蛋白质和RNA，介导靶向细胞间信号传递，甚至是遗传信息的功能性转移，这一发现极大地促进了该领域的发展^{[2, 4, 5]}。

间充质干细胞外囊泡及其功能应用

同样，间充质干细胞（MSC）也分泌大量的EV，EV内容物包括各种蛋白和RNA等。在MSC来源的EV中，大多数RNA（>80%）；另外还有一些小RNA，其中miRNA约为44%、tRNA约为47%^[6]。干细胞通过这些胞外囊泡（EV）与其他组织细胞相互交流信息，发挥干细胞的治疗作用。

MSC来源的EV也表达MSC表型标记，如CD29、CD73、CD44和CD105，可以通过传统的流式细胞术进行鉴定^[7]。蛋白质组学研究揭示人MSC-EV许多独特的蛋白质，如表面受体（PDGFRB、EGFR和PLAUR）、信号分子（RRAS/NRAS、MAPK1、GNA13/GNG12、CDC42和VAV2）、细胞粘附分子（FN1、EZR、IQGAP1、CD47、整合素和LGALS1/LGALS3），以及MSC相关抗原（CD9、CD63、CD81、CD109、CD151、CD248和CD276）^[8]。

MicroRNAs（miRNAs）是一种短的、非编码的RNA，它调节mRNA靶标的表达，并在转录后沉默中发挥作用。miRNAs在干细胞中的重要作用已经在广泛的生物学过程中得到了研究，包括发育、分化、细胞死亡、干细胞增殖和分化、免疫反应、衰老和癌症。据估计，人类基因组编码超过1000个miRNAs，针对大约60%的人类蛋白编码基因^[9]。通过质谱和阵列分析，已经在MSC-EVS中鉴定出850多个独特的基因产物和160多个miRNAs^{[10, 11]}。

组织损伤修复

MSC-EV已经在几种不同类型的疾病中显示出令人鼓舞的治疗效果，包括肾损伤、心脏损伤、脑损伤和肝肺损伤等^{[12, 13]}。MSC的旁分泌/内分泌机制很可能是由MSC-EV介导的^{[14, 15]}。MSC-EV恢复和维持组织微环境内稳的潜力取决于蛋白质和RNA转移的生化能力。

MSC分泌的EV在急性和慢性肾损伤中均有保护的特性^[16-18]。MSC-EV中的生长因子mRNA可以转移到顺铂损伤的近端肾小管上皮细胞(PTEC)，可促进PTEC增殖；IGF-1R的mRNA通过体外水平转移到肾小管上皮细胞，增强了肾小管细胞对局部产生的IGF-1的敏感性^[19]。如果骨髓MSC-EV的microRNA耗竭，那么MSC-EV在急性肾损伤中的固有再生修复能力出现显著的降低，提示在急性肾损伤后的恢复过程中，miRNAs起着关键作用^[20]。

在心肌梗死方面，体外扩增的MSC培养上清液已成功用于缩小小鼠心肌梗死范围[15, 21-23]。MSC上清液的促再生活性被证明为EV组分，而去除EV后的可溶性组分并没有作用效果^[15]。MSC-EV介导的细胞保护作用可减轻大肠杆菌内毒素诱导的小鼠急性肺损伤和低氧诱导的肺动脉高压^{[24, 25]}。MSC-EV还展示了减轻药物诱导肝损伤和肝纤维化的能力^{[26, 27]}。

MSC-EV对血管生成有直接的积极促进作用^{[28, 29]}。在大鼠模型中，MSC-EV显著改善了后肢缺血的灌注，加速了皮肤烧伤后的再上皮化，并提高了同种异体皮肤移植物的存活率^{[30, 31]}。MSC-EV给药已被证明在中风模型缺血性闭塞后促进功能恢复和新生血管，显著改善了卒中诱导后的功能结果，但是MSC组和MSC-EV组没有明显的疗效差异^{[32, 33]}。在绵羊模型中，全身应用MSC-EV后也观察到大脑缺氧损伤的改善^[34]。miRNA-133b似乎与MSC-EV介导的大鼠缺血性卒中后的功能恢复有关^[35]，而miRNA-22似乎与MSC-EV介导的缺血性心脏病心肌细胞的抗凋亡作用有关^[36]。因此，MSC-EV可用于中风的治疗，作为干细胞输注的替代方法，可改善神经预后，增加血管生成和神经生成^{[37, 38]}。

另外，研究表明，来自健康供者的骨髓MSC-EV含高水平的肿瘤抑制因子miRNA-15a，miRNA-15a能够抑制多发性骨髓瘤细胞的生长和诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡，从而维持疾病的稳定状态抑制多发性骨髓瘤细胞的生长；而来自多发性骨髓瘤患者的骨髓MSC-EV含低水平的肿瘤抑制因子miRNA-15a^[39]。健康和多发性骨髓瘤患者的骨髓MSC-EV激活AKT通路促进了骨髓瘤细胞的存活和抗药性^[40]。也有研究证明健康供者骨髓MSC-EV通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径，降低了骨髓瘤细胞的活性、增殖和迁移^[41]。

免疫调节功能

MSC来源的外泌体和EV具有相似的免疫调节功能，MSC-EV对许多类型的免疫细胞具有免疫调节作用，包括树突状细胞（DC细胞）、T细胞、B细胞和巨噬细胞^{[6, 42-44]}。然而，有意思的是，在炎性关节炎模型中，MSC来源的外泌体在体内抑制炎症比MSC更加有效^[45]。

MSC-EV对DC细胞的免疫调节作用机制部分是由microRNAs（miR-21-5p、miR-142-3p、miR-223-3p和miR-126-3p）介导的^[46]。MSC-EV还可以通过增强M2巨噬细胞极化和间接驱动调节性T细胞诱导发挥免疫抑制作用^[47]。MSC-EV还被证明可以抑制健康供者和GvHD患者的NK细胞和其他外周白细胞的激活^[48]。MSC-EVS在体外与PBMC共培养时抑制T细胞的激活，促进调节性CD4+CD25+FOXp3+T细胞的增殖^{[48, 49]}。

根据阵列分析，与GVHD改善相关的多种可溶性因子在MSC-EV中呈现高度表达^[50]。静脉输注MSC-EV可抑制CD4+T和CD8+T细胞的活化和浸润，从而延长急性移植物抗宿主病（GVHD）小鼠的存活时间，并减少多个器官的病理损伤^[51-53]。

间充质干细胞外囊泡的体内分布和安全性

在小鼠体内的生物发光和荧光介导的断层成像显示，静脉注射EV的主要部位是脾、肝、肺和肾，也可以在注射后30分钟内在脑、心脏和肌肉中检测到EV，在60分钟后尿液中检测到EV^[54]。

虽然已经观察到，在动物肿瘤模型和体外细胞实验层面，MSC-EV的促肿瘤和抗肿瘤作用的报道^{[55, 56]}，但到目前为止还没有其他副作用的报道。动物模型中没有检测到MSC-EV给药的任何副作用，即使用PEG方法制备的MSC-EV在动物身上的剂量比相应的急性GvHD患者高100倍。因此，可以认为MSC-EV给药基本上是安全的^[57]。由于EV不能自我复制，因此缺乏任何内源性肿瘤形成潜力^[58]。

间充质干细胞外囊泡的临床应用

2011年进行了第一次有记录的临床MSC-EV给药；MSC-EV以递增的剂量应用于1例类固醇耐药的GVHD患者，从4×107个MSC培养上清液中分离的MSC-EVS数量为1.3-3.5×1010个颗粒或0.5-1.6mg；这个剂量的MSC-EV被定义为1个单位，MSC-EV每隔2~3天静脉注射一次，共2周，患者总共接受了4个单位，GvHD症状显著下降，每日类固醇剂量可从125 mg减少到30 mg，患者在MSC-EV治疗后稳定了5个月，而且MSC-EV给药耐受性良好，未观察到副作用^[48]。

对20例慢性肾脏病（CKD）患者进行的Ⅱ/Ⅲ期临床研究表明，脐带MSC-EV（2次，相隔1周）可改善肾小球滤过率、血肌酐水平、血尿素和尿白蛋白肌酐比值，伴随着TGF-β1、IL-10水平明显升高和血浆TNF-α水平显著下降（在治疗后12周的TGF-β和IL-10水平高于一年后；相反，肿瘤坏死因子-α水平在一年后略低于12周后），没有一名患者显示出任何副作用^[59]。

MSC-EV应用于8例患者用于牙槽骨再生，没有出现不良反应；放射学评估显示所有病例均有早期骨形成；注射部位的炎性淋巴细胞浸润很少^[60]。这个临床研究证明了MSC-EV在骨再生医学中具有较大的成骨潜力。

对7例长期存在的大型特发性难治性黄斑裂孔（MH）患者，年龄51~75岁，行玻璃体切除、内界膜剥离、MSC（2例）或MSC-EV（外泌体）（5例）玻璃体腔内注射；5例MH闭合术患者最佳矫正视力提高，其中1例接受MSC治疗的患者在视网膜表面观察到纤维膜，1例接受较大剂量MSC-EV的患者出现炎症反应^[61]。

间充质干细胞外囊泡的产业化

MSC-EV具有免疫调节活性并促进再生过程，其方式显然与MSC相当。因此，基于EV的无细胞疗法，为多种疾病提供了一种基于干细胞治疗的有前途的替代方案^[12]。与细胞疗法相比，EV疗法具有一些优势，但由于该领域的新颖性，其临床分级生产、质量保证和应用缺乏国际公认的指南。

改变MSC的培养环境，用不同的外界刺激预处理，这不仅可以增加EV的产量，还可以调节它们的成分，从而增强有益的治疗效果^[62]。例如，无论是用中风患者血清培养MSC，还是用缺血脑组织提取液处理，都可以激活MSC释放更多的EV ^{[63, 64]}。MSC培养时给予炎症刺激，将增强抗炎特性的EV释放^[65]。应当评估EV制备的纯度和一致性，在EV收获过程中使用的所有生物材料都符合要求的法规遵从性。

与传统的2D平面培养的MSC相比，与微载体结合的3D球形培养的MSC显示出更高的EV分泌量，并降低了整合素的表达，原因可能在于3D培养的MSC细胞密度高于2D培养[66-68]。采用3D的培养方法方法在MSC-EV的生产中可能有优势，因为(1)需要大量的培养基才能获得大量临床使用的EV；(2)通过持续的培养基灌流，避免代谢副产物在生物反应器中积累，可以维持MSC的活性，而无需使用含有大量异种EV的血清；以及(3)通过控制进出生物反应器的培养基流量来连续产出^[37]。

超速离心是收集EV最常用、最常规的方法。商业上可以买到的试剂盒，是一种快速而简单的试剂盒，但它是一种相对粗糙的分离方法，受到许多可溶性蛋白污染。超速离心的方法足以获得纯EV用于实验室实验，但在临床环境下，这种方法耗时长，不适合大规模生产EV。

超速离心促进囊泡聚集，常常共分离到可溶性因子和蛋白质^[69]。基于密度梯度的分离允许基于浮力密度分离囊泡，为EV净化提供了最高效率^{[70, 71]}。最近，一些新兴的技术，如尺寸排除色谱、声学分离、纳米捕捉器、流场流动分级，都有可能从不同的样品基质中分离出EV，每种方法都利用了EVS的特定生物物理特性，如它们的大小、密度、形状或表面受体^[72]。

以EV为基础的治疗药物生产的另一个方面是质量保证。虽然来自几个动物模型和已报道的人体研究的数据表明，MSC-EV发挥了治疗作用，没有引起副作用，但必须建立适当的质量控制标准，以确保所产生的EV产品的质量、安全性和有效性。EV储存在等渗缓冲液中，以防止储存和冻融循环期间的pH变化。比如人中性粒细胞来源的抗菌胞外囊泡（EV）在-80°C下保存对EV数量和大小没有显著影响（最好不超过7天），而广泛使用的冷冻保护剂能诱导EV裂解^[73]。

因此，为了开发基于EV的药物，至少需要克服一些限制：(1)为EV的大规模制备、纯化和储存建立推荐的分离方案；(2)EV的量化、分子和物理EV表征的标准化方案；以及(3)明确的临床使用质量控制(QC)标准^[58]。

干细胞外泌体（特指MSC-EV）是一个研究和应用都值得期待的好方向，但是需要脚踏实地地去做些工作。

基于MSC，超越MSC !

作者：王汉裕

长期从事间充质干细胞基础研究与转化应用。主持中国博士后科学基金和省部级基金各1项。获授权专利1项，发表论文20余篇，其中参与的干细胞研究论文发表在Cytotherapy、Cellular Immunology等杂志上。

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