用于mRNA的先进递送系统
本文节选自《Three decades of messenger RNA vaccine development》，更多详细内容，请参考原文。
原文重点：
mRNA是疫苗接种方案中一种非常有吸引力的抗原来源
未制剂的裸mRNA和纳米颗粒mRNA均可用于直接体内免疫
纳米制剂可拓宽mRNA疫苗的给药和递送选择
mRNA的自我佐剂效应对于疫苗效力来说是一把双刃剑
将mRNA肿瘤疫苗与检查点抑制方案相结合具有一定合理意义。
原文图片摘要
基于mRNA的(肿瘤)疫苗的开创性步伐和里程碑
用于mRNA的先进递送系统
纳米颗粒：开辟了新的道路
尽管使用裸mRNA获得了一些成功，但是针对用于mRNA疫苗递送的纳米颗粒的研究早已开始，背后的原因是，mRNA纳米医药可作为多功能制剂，从疫苗递送考虑，扩大了疫苗的选择范围。首先，纳米颗粒中的mRNA在酶解条件下可获得更好的保护，这使新的给药途径成为可能，如静脉注射。此外，通过将mRNA制剂形成纳米颗粒，可改变其生物分布、细胞靶向以及细胞摄取机制，从而促进mRNA的递送以及疫苗的效果。
尽管已经明确的一点是，纳米颗粒的选择和优化是实现成功mRNA转染的关键，但是需要注意的是，许多研究显示，在培养细胞中的转染实验不能可靠地预测mRNA制剂的体内行为。Bhosle等的研究进一步证实了mRNA体外和体内递送的显著差异，其观察到体外和体内递送过程中涉及到完全不同的细胞摄取通路，这对于裸mRNA和含有mRNA的脂质纳米颗粒（LNP）来说，均是如此。此外，通过使用高通量系统，Paunovska等测试了数百种用于在静脉给药后，将核酸递送至巨噬细胞或内皮细胞的LNP，结果发现几乎没有体外-体内相关性。这些研究提出了这样一个问题：相信基于纳米颗粒的策略可以被合理设计，以发挥其作为mRNA疫苗增强模体的多功能作用，是否只是空想？在接下来的章节中，作者讨论了设计用于mRNA免疫的纳米颗粒时的一些关键考量因素，并特别关注mRNA LNP，因其中的部分已经进入了临床试验的早期阶段。已经有文章总结了用于mRNA递送的不同化学性纳米颗粒组成，包括，但不限于，鱼精蛋白、脂质或聚合物、以及混合制剂。
用于mRNA递送的脂质纳米颗粒的设计和制备
已经被测试用于mRNA递送的脂质体制剂通常由阳离子/离子化脂质和其它“辅助”脂质组成，如磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇（PEG）脂质。通常包括阳离子脂质是为了实现带负电荷的mRNA分子的静电络合，其可以根据氨基基团的pKa粗略地分成i）“永久带电的脂质”，如DOTMA、DOTAP和DC-胆固醇，或ii）“pH-依赖性离子化脂质”，如D-Lin-MC3-DMA和脂质样分子C12-200。这些离子化脂质（pKa<7）最初优化用于siRNA的递送，在生理pH条件下，带有中性到温和的阳离子电荷。相比永久带电的脂质，其具有特定的优势，其中最重要的是，离子化脂质与更低的毒性以及更长的血液循环寿命有关。其它脂质成分被认为是“辅助脂质”，由于其独特的功能特性，可能可影响复合mRNA LNP的结构排列，从而提高其稳定性或促进mRNA胞内摄入以及胞质进入。
mRNA脂质纳米颗粒的代表性示意图。氨基脂质（阳离子或离子化脂质）和辅助脂质的选择会影响制备的mRNA LNP的结构排列及功能特性。需找到正确的平衡，以获得在生物环境中足够的颗粒稳定性，同时，结构需可在靶细胞中解离，LNP应能促进mRNA的内体释放。
影响整体转染效率的关键障碍之一是吞噬后mRNA LNP的内体降解。为了修饰和优化mRNA LNP，以促进mRNA货物从内体至胞浆的转运，已经做了大量的工作。mRNA内体释放背后的机制被认为取决于LNP的质子化（电离的）脂质与核内体膜中阴离子磷脂的脂质混合步骤。这些脂质之间离子对的形成会触发膜融合以及膜去稳定化，进而增强mRNA分子从内体的逃逸。此外，该脂质置换过程被认为可诱导非双分子结构的转化（即从层状到倒六角形相），导致LNP解离，支持核内体膜的去稳定化。已经有研究将mRNA和脂质成分的结构组织与最终可达到的转染效率联系起来。值得注意的是，mRNA的理化和结构特性取决于脂质组成、mRNA与（阳离子）脂质总量之比、以及LNP的合成。
当通过将mRNA与含有永久带电脂质的预成型（单层）脂质体混合，而制备mRNA LNP时，脂质体重新组织，以形成多层结构，其中，mRNA分子夹在同心脂质双层之间。饱和磷脂的加入，如DPPC和DSPC，可提高阳离子脂质体的相变温度，支持此类层状脂质双层结构的形成。相反，不饱和磷脂DOPE会促进非层状脂质相的形成（即倒六角形相），其有助于内体逃逸。但是，后者可能只在体外条件下如此。在临床前试验中，DOPE的加入与阳离子（DNA）LNP增加的血清诱导解体有关，进而降低体内转染效率。
mRNA LNP生产的另一种策略是乙醇稀释，这种方法适合制备技术上更加先进的、含有离子化脂质的LNP系统。操作时，各种脂质溶解在乙醇中，然后与酸性水缓冲液中的mRNA快速混合。通过稀释乙醇相，脂质会经历一个凝结过程并形成LNP，同时有效包封mRNA。之后，通过透析步骤，中和缓冲液，以去除乙醇并中和pH。Kulkarni等最近发表的文章已经阐明了这种离子化LNP系统（含有不同核酸荷载）的形成机制。他们提出，在酸性pH条件下的快速混合步骤中，形成（“空”）的小粒径脂质体结构与（“负载”）的大粒径电子致密颗粒。然后，在透析步骤中，随pH被中和，颗粒发生融合，最终形成LNP系统。此外，他们证实，PEG-脂质内容物通过在颗粒表面施加排斥力，限制进一步的融合，从而决定了最终LNP的粒径。在另一项研究中，Yanez Arteta等指出，基于D-Lin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇以及PEG-脂质的mRNA LNP的结构排列呈现出含D-Lin-MC3-DMA、胆固醇、水和mRNA的无序倒六边形相。核被脂质单层围绕，后者主要含有DSPC和DMPE-PEG2000以及一部分D-Lin-MC3-DMA以及胆固醇。有意思的是，通过调节不同脂质的摩尔比，研究人员可生产具有不同表面特性的mRNA LNP。他们发现，LNP组成利于D-Lin-MC3-DMA脂质从内核到外表面的部分分离，这与更高的转染效率有关。相反，表面DSPC含量较高的mRNA LNP（几乎达到纯DSPC单层）的转染能力较弱。此外，研究人员认为，胆固醇的富集可能导致LNP表面纳米晶体的形成。虽然该研究没有进行进一步的实验，但之前的报道已经将胆固醇纳米晶体的出现与更高的转染效率联系起来。
mRNA疫苗递送方式
值得注意的是，实验室规模台式微流混合设备已经可以通过乙醇-稀释原理，用于空载脂质体或mRNA LNP的生产，且有潜力规模放大至临床或工业化应用。此类微流设备可按良好控制且高通量的方式生产LNP，这无疑可促进用于基因递送的新型LNP的临床转化。除了优化生产过程，新型脂质库的快速筛选也有助于持续优化脂质组成。此外，这也可支持新型离子化脂质的发现，这对于提高mRNA转染的效力和安全性有极大的帮助。
除了LNP设计和生产方面的进展外，对转染体内细胞的作用机制的了解也至关重要，需要进一步的研究。尽管膜融合的理论已经出现了近十年，但是LNP促进mRNA胞质递送的机制不能简单地归为单一的原因。最近，更多的研究表明，mRNA LNP的内吞转运是一个动态过程，涉及到mRNA胞质进入和翻译的循环通路以及信号通路。例如，研究发现，位于晚期核内多聚体上的C-1型Niemann-Pick转运体，被认为与大部分内化(si)RNA LNP的胞吐过程有关。相反，将雷帕霉素复合物1的机械靶点募集到溶酶体膜的过程是触发所递送mRNA翻译的关键。
研究比较少，但是可能同样重要的是，细胞进入机制与mRNA胞内运输之间的关系。通过将mRNA LNP靶向DC表达的选择性表面受体，颗粒可能可被引导到对mRNA降解较低的胞内运输通路。这样，(mRNA)纳米疫苗可靶向C型凝集素DEC-205、CLEE9A以及甘露糖受体，这些受体也参与了利于死亡细胞抗原摄取、内吞保护以及交叉递呈的通路。
原文：R.Verbeke, I.Lentacker, S.C.De Smedt, Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today, 2019, https://doi.org/10.1016/j.nantod.2019.100766.
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