RNA疫苗：快速开发和部署，以应对大流行病所需疫苗用量

本文节选自《Rapid development and deployment of high-volume vaccines for pandemic response》，详细内容，参考原文。

疫苗被认为是最有效的医疗干预方式，有望克服目前由SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19大流行。开发有效的SARS-CoV-2疫苗最有希望的技术之一是基于RNA和病毒载体的平台。RNA疫苗平台基于分子生物学的中心法则，利用天然细胞蛋白表达途径，将DNA编码的遗传信息转录成信使RNA (mRNA)，并翻译成蛋白质。通过这种方式，RNA疫苗学根据RNA序列的信息，将疫苗蛋白抗原的生产“外包”给人体细胞。为达到此目的，RNA疫苗一般主要使用脂质体剂型(脂质纳米颗粒或聚脂剂型)注射到肌肉中。一旦进入细胞，核糖体就会产生RNA序列编码的蛋白质，对于COVID-19疫苗来说，这种RNA序列就是SARS-CoV-2病毒表面的刺突（spike）蛋白。然后，产生的蛋白抗原(表达为刺突蛋白三聚体)诱导获得针对病毒的免疫所需的免疫反应。RNA疫苗主要有两种类型，mRNA和自扩增RNA (saRNA)疫苗。正如其名称所示，saRNA疫苗，通过在saRNA链中编码病毒RNA复制机制，并在人体细胞内表达，从而在细胞内复制。这样，每剂疫苗所需的RNA量更低，就每升生物反应的剂量而言，与非复制的mRNA疫苗相比，潜在地提供了可观的成本效益和更高的生产效率。但另一方面，与saRNA疫苗相比，mRNA疫苗在临床上发展更快，也得到了更广泛的测试。以病毒载体为基础的疫苗，如腺病毒载体疫苗，也利用人体细胞合成靶抗原，但在COVID-19疫苗中，它们先将DNA荷载转录成mRNA，然后翻译成刺突蛋白。在RNA疫苗临床试验正在进行的情况下，我们对RNA疫苗生产进行了技术 - 经济分析，并介绍该平台在研发速度、生产占地以及疫苗成本方面的优势。

开发时间线

传统疫苗的开发平均需要8 - 14年，花费5.5 - 10亿美元，如下图所示。如果能够迅速招募患者并检测，那么，为应对大流行病而实施的快速跟踪管理程序可以将临床前和临床开发的时间缩短至0.8年至1.5年。新兴的平台技术，如RNA平台，以前所未有的速度推动着临床前的发展进程。例如，位于伦敦帝国学院的Shattock集团在从SARS-CoV-2病毒筛选了spike蛋白基因序列后的两周内就生成了saRNA候选疫苗原型。美国公司Moderna, Inc.从用于临床物料生产的基因序列信息到人体测试只用了42天。这种快速进入临床物料生产的发展速度为面对大流行的多种候选疫苗的临床研究提供了巨大的优势。在临床开发过程中，III期临床试验的成本最高、持续时间最长，而评估疫苗疗效的II期临床试验失败率最高，参考下图。（相关新闻链接：Moderna斥资13亿美元，扩大mRNA COVID疫苗生产规模）

疫苗试验和生产开发时间表概述。A、传统疫苗和使用新兴平台技术生产的疫苗(如RNA疫苗)的临床前开发和临床试验时间表、成本和成功率。一旦该平台被开发出来并用于生产获批产品，使用同一平台技术开发更多产品的成本和失败率将大幅下降。在III期临床试验中，成本最高，开发时间最长，而在II期临床试验中失败率最高。B、具有年产量数千万至数亿剂药物底物的常规和新兴平台技术的工艺开发以及工厂建设时间表和费用估算。工艺开发和工厂设计通常在临床前和临床试验期间启动，投资通常在临床开发过程中，确定失败风险降低时进行。C、比较传统和新平台技术的疫苗总产率，考虑了上图A和B部分所述的开发和测试阶段。一旦完全开发和验证，新的疫苗平台技术将在抗原鉴定后的几周到几个月内生产疫苗，这至少比传统技术快10倍。

一旦RNA疫苗的cGMP平台生产工艺被开发出来，RNA疫苗的生产速度将大大快于传统表达系统。例如，在灭活或衰减病毒(如使用Vero细胞生产的PiCoVacc SARS-CoV-2病毒候选疫苗)或重组蛋白疫苗候选生产中，必须开发产物特异性的生产工艺，并针对cGMP生产进行优化、验证和审批，需花费大量的时间。此外，RNA平台的灵活性与疾病目标无关，这意味着可以快速生产和测试多个迭代和疫苗变体，而不需要修改工艺或重新验证。

RNA平台的单位体积和单位时间产量也远远高于上述传统表达系统。这使得后期试验和大规模生产所需的更高产量的生产可被大大简化。随着该平台的全面开发和RNA疫苗接近获得监管部门的批准，预计RNA平台所带来的时间和资源效益将更加明显。

生产工艺和占地

在成功的临床试验和有效性证明之后，下一个挑战是按照满足全球需求所需的质量标准、规模和速度，生产疫苗。这对于应对大流行的生产来说尤其困难，因为需要在当前良好生产规范(cGMP)下，在几个月内生产数十亿剂疫苗，而且最好以足够低的成本进行，使人们能够负担得起，以在全球范围内，进行大规模免疫接种。符合cGMP的小规模RNA疫苗生产工艺已经开发出来，GMP级的RNA疫苗候选疫苗已经可生产用于临床试验。鉴于目前的COVID-19大流行状况，数家公司和财团正在计划将RNA疫苗的生产规模扩大到每年10亿剂的数量。

对于快速反应型生产来说，实现现有设施的最佳利用至关重要，但如果需求不能得到满足，就迫切需要建造更多的设施。需要指出的是，通过重新部署现有的大规模设施，来生产针对COVID-19等新疾病的传统形式“新”疫苗(如灭活病毒疫苗)，也会对其它药物的供应产生不利影响。由于此类传统工厂的建设大约需要几年时间和数亿美元的投入，某些新兴的平台技术为快速-响应生产带来了相当大的优势。

我们已经基于最先进的工艺，在SuperPro Desinger (Intelligen, Inc .)中建立了针对RNA疫苗生产的工艺模型，通过由T7 RNA聚合酶催化的体外转录反应，使用基于DNA-模板的RNA合成方法，进行了工业化的RNA合成，参见下图工艺流程。编码SARS-CoV-2 刺突蛋白的saRNA疫苗药物底物大小约10 kb，分子量约5 MDa，相比编码相同刺突蛋白的mRNA疫苗药物底物（大小约为3-4 kb，相应分子量约为1.5-2 MDa），其显然更大。saRNA和mRNA的分子量比T7 RNA聚合酶高出一个数量级，因此基于粒径从RNA中分离T7 RNA聚合酶似乎是可行的。RNA合成后，可通过一系列的切向流过滤(TFF)步骤进行下游纯化，据报道其纯度可达90%至99.9%，产量可达90%至95%。TFF后还可以通过层析技术进行进一步的纯化，如羟基磷灰石层析、oligo(dT)层析、离子交换层析和复合模式层析(如Capto core 700)。所制备的RNA药物被制剂成脂质纳米颗粒，以完成以LNP包封/制剂的RNA生产。整个LNP包封工艺和制剂与RNA序列以及目标疾病疫苗药物产品无明显关系。一旦制剂的RNA准备就绪，它就可以进入灌装过程，在这个过程中，需要的剂量被装入到玻璃瓶中，以生产最终的疫苗药物产品。

基于体外转录酶反应的saRNA疫苗生产工艺流程图。在上游工艺中，DNA模板生成、扩增、纯化并线性化。在中游工艺中，使用T7 RNA聚合酶，通过体外转录反应，合成RNA，并使用5' 帽类似物进行共转录，实现RNA的5'加帽(需要确保抗原的表达)。对于下游纯化，可使用TFF，并选择性结合层析方法进行，如羟基磷灰石层析和复合模式层析。在第一个TFF步骤中，saRNA和线性化的DNA模板被过滤器保留，较小分子尺寸的成分，包括T7 RNA聚合酶，通过过滤器。接下来，使用核酸酶消解线性化的DNA模板，然后使用另一个TFF步骤将DNA核苷酸从RNA中分离出来。然后，所获得的药物底物以脂质纳米颗粒制剂，此外，聚阳离子制剂也已开发和评估。接下来，制剂好的saRNA经过质量控制，装入针对大流行的大规模疫苗接种的小瓶或容器。然后瓶子盖上，密封，使用自动图像处理检查，贴标签并包装至二级和三级包装。整个生产过程与RNA序列无关，因此，原则上，几乎针对任何疾病的疫苗都可以用同样的生产过程生产。

基于我们的技术 - 经济评估，从工厂规模看，RNA疫苗生产工艺可以比传统疫苗生产工艺小两到三个数量级，并且可以在不到一半的时间内，以1/20到1/35的前期资本投入，完成建设。因此，它所要求的小规模、高产量工厂具有强大的优势，可以更迅速地建造，并可广泛地使用一次性使用设备。由于其规模较小，RNA疫苗药物底物的生产工艺可以放在现有传统疫苗工厂的一小部分内进行，例如单个房间，但仍然可比传统疫苗整个生产工厂生产更多剂的药物底物。要快速建立这样的RNA疫苗药物底物生产线，可以使用现成的一次性使用设备构建整个工艺流程。一旦基于现成的一次性使用设备建立并验证了这种工艺，技术就可以转移到其它工艺，以扩大规模，从而减少工艺和质量控制设计以及开发的时间线，并简化验证和启动工作。

此外，RNA疫苗平台技术为使用相同的生产工艺、质量控制系统和设备，快速且高产地生产非常大范围的疫苗产品提供了灵活性。因此，与传统疫苗生产技术相比，新疫苗的生产可以加快10倍左右。在这种情况下，除了规模外，RNA疫苗药物底物生产工厂成本还取决于洁净室的级别或所需的控制级别。如果RNA的生产可以在一个封闭的系统中进行，那么，甚至可以使用低级别的工厂和洁净室，相比具有高级别洁净室的工厂，其建设、运营和维护成本将大大降低，但当然，这需遵循特定的适用法规和合规指南。

工艺性能和成本

基于我们在SuperPro Designer中的工艺 - 成本建模，saRNA平台每年可生产超过10亿剂疫苗的药物底物，使用相当于5升生物反应器工作体积的小规模工艺，以及相应较小的工厂占地，后者的建设、装备、验证和启动成本仅约为2000万美元。由于RNA合成和LNP生产所涉及的原材料成本较高，预计每年运营成本超过1亿美元。这1亿美元/年的估算包括物料和耗材成本、人工成本、工厂相关成本、质量控制和质量保证成本以及废物处理成本。其中，5' 帽类似物原料是主要的成本组成部分，占总运营成本的50%以上。对于mRNA和saRNA疫苗，效率最高的5' 帽类似物分别是CleanCap AG和CleanCapAU (TriLink Biotechnologies, Inc.)。5’帽结构对于避免RNA被先天免疫机制降解至关重要，它将无帽RNA与外来物质(如病毒)相关联，并保证RNA聚合物中蛋白抗原的表达。目前正在扩大5' 帽类似物的生产规模，以确保可获得10亿剂规模的RNA疫苗生产。因此，我们不认为5' 帽类似物的供应会成为瓶颈，尤其是saRNA的生产，尽管不能排除在响应大流行的大规模疫苗生产期间，原料短缺的可能性。

影响RNA疫苗生产性能和成本的参数。

据估计，saRNA和mRNA疫苗的每剂RNA药物底物分别在0.1-10μg/剂和25-250μg/剂之间。实际的量将在临床试验中确定。鉴于每剂RNA药物底物用量的差异和范围，每剂的价格、产量和产率将相应变化。这与这些疫苗最初的预期目的一致：mRNA疫苗最初是作为抗肿瘤疫苗开发的，没有优先考虑每剂的超低成本。另一方面，saRNA疫苗已被开发用于传染病和快速响应大流行病，并考虑了发展中国家的购买力，因此旨在将每剂疫苗的成本降到最低。根据我们的成本模型，对于saRNA疫苗，每剂的成本低于1美元/剂，包括最终灌装成一瓶多剂的选择，这对于saRNA疫苗来说，似乎是可以实现的。每剂的药物底物成本和产率，以单位时间生产的药物底物剂量值为单位，与每剂的药物底物量有线性关系。这样，如果saRNA疫苗的剂量从10变成0.1μg/剂，每剂的药物底物成本可以大大降低，生产力可以提高两个数量级。如下表中所列，除了每剂的RNA量，mRNA和saRNA疫苗每剂成本和生产工艺性能将取决于工艺规模、生产滴度、5 '帽类似物的成本以及使用的5’加帽方法（共转录 vs 转录后酶处理)、下游纯化方法的效率和成本、与工厂相关的成本以及回收高价值材料以用于相同产品后续批次的可能性。如果生产批次的安排是一批次的结束与后续批次的开始重叠，以提高生产线的利用率，则生产一批RNA药物底物所需的时间约为11小时。连续RNA合成的生产工艺中，RNA产品不断流出生物反应器，高价值的原材料被保留在生物反应器内，也提供了一个实质性降低材料成本的可能性。除了生产成本，疫苗的最终销售价格预计还将包括研发成本、临床试验成本、营销和供应链成本以及利润率。

原文：Z.Kis, C.Kontoravdi, A.K.Dey, et al., Rapid development and deployment of high-volume vaccines for pandemic response. Journal of Advanced Manufacturing and processing, 2020, DOI: 10.1002/amp2.10060.

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