使用DOE方法，获得高产量AAV载体生产平台

本文节选自Amgen研究人员2020年发表于《Molecular Therapy: Methods & Clinical Development》的文章“Creation of a High-Yield AAV Vecotr Production Platform in Suspension Cells Using a Design-of-Experiment Approach”。详细内容，请参考原文。

重组腺相关病毒(rAAV)载体是目前最主要的基因传递平台，但载体的生产仍然是一个不小的挑战，需要新的方法来提高rAAV的产量，并降低成本。过去提高rAAV产量的工作主要通过一次优化单个变量的方式，但这种方法没有考虑多种因素的相互作用对载体生产的影响。在这里，研究人员使用实验设计(DOE)方法，来优化HEK293T悬浮细胞系统的rAAV生产。研究同时改变了转基因、包装和辅助质粒的比例、总DNA浓度和细胞密度，以系统性地评估52种条件下每个变量的影响。结果显示了一套独特的参数组合，与之前描述的方法相比，使用更高浓度的转基因质粒、更高浓度的包装质粒，以及更高的细胞密度。使用这种DOE-优化的方案，实验获得了接近3x10^14 VG(病毒基因组) / L(细胞培养)的未纯化产量。此外，研究的下游工艺结合了基于聚乙二醇(PEG)的病毒沉淀、pH-介导的蛋白质去除以及亲和层析，针对涵盖13种血清型和衣壳异构体的rAAV-EGFP，平均纯化产量>1x 10^14 VG / L。

简介

重组腺相关病毒(rAAV)载体是一种领导性的基因传递平台，最近已有多种rAAV介导的治疗方法获批。尽管在临床中取得了这些进展，rAAV载体的生产仍然是一个挑战。例如，I/II期的B型血友病试验需要使用超过400个10层细胞堆栈，才能产生足够6名患者使用的物料。虽然试验是成功的，但是这些研究也凸显出需要新的方法来优化载体的生产。提高生产效率将降低生产成本，提高患者的可及性，并使这一新兴治疗模式有可能用于更多的适应症。

影响rAAV载体生产的因素很多，包括生产细胞系、细胞密度、培养基、收获时间、质粒DNA总量、转基因(pAAV)的比例、包装(pRC，编码AAV Rep和Cap基因的质粒)和pHelper质粒。通常，研究小组通过每次修改一个因素(OFAT，One Factor at A Time)来优化载体生产。例如，Durocher 等通过评价不同质粒比例、细胞密度和收获时间，优化了HEK293悬浮细胞中rAAV2的生产。他们在OFAT-优化的系统中，获得了接近3x10^13 VG/L的纯化前产量。同样，Grieger等通过分别改变HEK293悬浮细胞系统中的质粒比例、转染试剂与质粒DNA的比例、总质粒DNA浓度以及细胞密度，分别实现了大于1 x 10^14和1x10^13 VG/L的纯化前、后产量。与这些研究小组类似，我们最初使用基于OFAT的方法在悬浮细胞中开发了一个公司内部的rAAV生产系统。以rAAV5为代表载体，我们评估了不同细胞系、收获时间、细胞密度和质粒浓度，以优化病毒生产。尽管我们成功地提高了rAAV5载体的产量，但该方案未能使其它血清型获得相似的产量。这些结果促使我们探索优化rAAV生产的新方法。

实验设计(DOE)方法已被成功用于优化生物技术工艺，如抗生素的生产、抗体的产生以及胚胎干细胞的扩增。与基于OFAT的优化不同，DOE驱动的方法允许评估多个相互依赖的因素对给定输出的影响。在本研究中，我们使用DOE方法，优化在HEK293T悬浮细胞系统中进行的rAAV载体生产。据我们所知，这是DOE方法在rAAV载体生产优化中的第一次应用。我们同时改变了转基因、包装和辅助质粒的浓度、总DNA浓度以及细胞密度，以系统性地评估涵盖52种不同条件的每个变量的影响。数据分析得出一个独特的参数组合，与之前描述的基于OFAT的方法相比，该方法使用的参数组合具有更低浓度的pAAV、更高浓度的pRC以及更高的细胞密度。通过这种DOE-优化的方案，我们获得了接近3 x 10^14 VG/ L(细胞培养)的未纯化产量。此外，我们将基于聚乙二醇(PEG)的病毒沉淀、pH-介导的蛋白质去除以及亲和层析整合至下游工艺，从而针对13种血清型/衣壳异构体大于1x10^14 VG / L rAAV-EGFP载体的平均纯化产量。该产量显著高于之前报道的悬浮细胞三质粒转染 > 1 x 10^13 VG / L的最高产量。

详细实验操作和结果，请参考原文。

图1. OFAT-优化的rAAV5悬浮细胞生产方案

(A和B) HEK293-6E和HEK293T悬浮细胞(20ml)以1x10^6 /mL的密度接种至125mL摇瓶(110 rpm)，使用PEIMAX转染pAAV-EF1α- EGFP(1μg/mL)，PEIMAX /质粒DNA比为3:1。在24和48 HPT收集细胞并固定。流式细胞术定量平均荧光强度(A)和EGFP-阳性细胞百分比(B)。(C)优化质粒总量。HEK293T悬浮细胞(20ml)以0.5x10^6/mL的密度接种125mL摇瓶。使用PEIMAX进行细胞转染，使用指示的DNA浓度(PEIMAX/DNA = 3:1)，质粒比为2:1:1 (pHelper/pRC/pAAV-EGFP重量比)。18HPT时，在悬浮培养中加入丁酸钠(5mM)和TN1(0.5%)。在65hpt左右，细胞离心，重悬的细胞颗粒进行三次冻融循环。离心下细胞碎片后，用免疫印迹法分析上清中的衣壳蛋白。上图每栏含15μg蛋白质；下图每栏含有10μL细胞裂解液。(D)如(C)所示生成rAAV。细胞以不同的密度接种，以总质粒DNA 1.5μg/mL进行转染。(E) 如(D)生成rAAV，使用细胞密度 0.5 x 10^6 /mL。在指示的时间点收获细胞。(F) 如(E)生成rAAV，收获时间为72 HPT。研究了丁酸钠和TN1对rAAV衣壳生产的影响。

图2 DOE优化的方案，提高多种血清型的rAAV生产

(A和B)比较用于AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAV9生产的OFAT和DOE优化方法。20mL悬浮HEK293T细胞使用OFAT优化(针对rAAV5载体生产优化)或DOE优化(针对rAAV8载体生产优化)的方案进行转染。在65HPT时，rAAV收获并用AVB-Sepharose纯化。细胞裂解液中的相对滴度(A)和衣壳蛋白(B)分别用bDNA和免疫印迹法(每栏10 μL)分析。使用Odyssey扫描在700nm处对免疫印迹条带进行定量，并显示相对强度(下图)。(C)使用DOE优化方法进行的不同血清型和衣壳异构体的大规模(1L) rAAV-EGFP生产的产量。用亲和层析一步纯化rAAV，用CyQuant法测定滴度。注意，AAVDJmCherry和AAV2mCherry中的mCHerry在衣壳表面。(D)用CaPO4法转染贴壁HEK293T细胞，每细胞堆栈使用3mg DNA ，质粒比为1:5:0.31 (pHelper/pRC/pAAV重量比，左)或每细胞堆栈4mg DNA 4mg，质粒比2:1:1(右)。纯化携带不同转基因的rAAV8载体 (每组n = 6)，显示每个细胞堆栈的相对滴度。用CyQuant法测定滴度。

图3. rAAV生产系统概览

(A) 上图：在悬浮HEK293T细胞(1 L)中生产rAAV1 -空载体，收获的细胞和培养基沉淀重悬，三次冻融循环，并用Benzonase核酸酶处理。总裂解液的一部分不调整或调整pH值至7.0或5.5，离心12,000 x g 15 min。澄清上清液的pH值调整到8.0，使用抗衣壳蛋白抗体进行免疫印迹分析。下图：使用Odyssey扫描定量的免疫印迹的条带。(B)利用DOE优化方法进行的不同血清型和不同转基因的227次大规模rAAV生产的产量。亲和层析纯化rAAV，用CyQuant (CQ)法测定滴度。(C)我们的rAAV生产工艺方案。(D)比较内部ddPCR滴度与ATCC的rAAV8参考标准库(AAV8RSS)。内部rAAV8-EGFP制备样品(AAV8 #1和AAV8 #2)的ddPCR滴度也与CQ法测定的滴度进行了比较。在三种不同的稀释下进行三次滴度测定。

讨论

尽管rAAV介导的治疗方法在临床中取得了非常有希望的进展，但载体生产仍然是一个挑战。以前优化载体生产的工作主要通过一次修改单个变量的方法，但这些方法没有考虑到影响rAAV载体生产的多种因素的相互依赖性。据我们所知，DOE方法此前未被应用于rAAV载体的生产。在本研究中，我们利用DOE方法，在HEK293T悬浮细胞体系中，通过同时改变转基因、包装和pHelper质粒的比例、总DNA浓度和细胞密度，来优化rAAV的生产。总的来说，我们系统性地评估了52种不同的条件，并成功地确定了一套用于rAAV生产的独特参数组合，从而提高了rAAV的产量。与之前报告的常用的2:1:1的比例(pHelper/pRC/pAAV重量比)的方案相比，我们确定了1:5:0.31的优化质粒比例(pHelper/pRC/pAAV重量比)。假设输入的总质粒DNA量相同，这将使pAAV DNA量降低5.1倍。根据目的基因，源于pAAV质粒的转基因表达可能对生产细胞有毒。因此，降低pAAV DNA的量可能有利于rAAV的生产，特别是转基因可能影响细胞活性和rAAV包装时。DOE优化方案的另一个特点是pRC质粒量的增加(1.19 mg/L)，占转染过程中使用的总质粒DNA的近80%。Cap蛋白的生产已被确认为rAAV生产的限制因素，而通过启动子调节Cap基因表达的增加已被证明可以使rAAV的生产增加10倍。因此，DOE方案中，pRC质粒量的增加可能有助于提高rAAV产量。尽管较高量的pRC可能提高载体产量，该质粒的增加也可能导致空颗粒数量的增加。此外，尽管我们通过亲和层析得到了高质量的rAAV，但这种方法并不能特异性地去除空颗粒。我们将这些rAAV周期性地对免疫完整的小鼠进行给药，观察到体内强而持续的转基因表达，表明这些制剂中的空颗粒水平对体内转导没有大的负面影响。然而，业界开始越来越多地认识到空颗粒可能会影响rAAV介导的基因递送。未来的研究将研究OFAT和DOE方案之间空颗粒比例的变化，并评估采用其它空颗粒去除方法的可能性。最后，在DOE优化的方案中，与质粒比例为2:1:1 (pHelper/pRC/pAAV)相比，pHelper降低到1 / 3。由于E2A和E4基因可能诱导细胞毒性，pHelper质粒量的减少可能有利于rAAV的生产。在我们使用OFAT优化rAAV5生产的初步研究中，我们观察到当细胞密度大于1x 10^6 cells/mL时，病毒衣壳蛋白表达降低。相反，来自DOE-优化方案的数据表明，在相同的总DNA浓度条件下，最佳的细胞密度为2.5 x 10^6 cells/mL。这种差异可能是由于在DOE系统中更高的pRC质粒水平所致，其可能填补了更高细胞密度的需求。这些观察结果强调了细胞密度和质粒比率之间的复杂关系，并突出了DOE方法的优势。

ddPCR分析显示，DOE-优化的方案使我们获得了接近3x10^14 VG/ L(粗裂解液)的产量。重要的是，通过DOE优化的方法获得的纯化前产量(从体积上)与杆状病毒载体/sf9细胞系统(2.5-3.5x10^14 VG/L)的产量相当，而后者被认为是目前最有前途的rAAV载体生产平台之一。由于这些结果是利用内部的HEK293T悬浮细胞系和修饰的pRC质粒获得的，因此本方案可能不适用于所有HEK293T悬浮细胞系或质粒，需要按情况进行评估。在这些研究中，我们还将基于PEG的病毒沉淀、pH介导的蛋白质去除以及亲和层析整合到了我们的下游工艺，使我们能够在多种血清型和转基因的实验中获得8.92 x 10^13 VG / L的平均纯化产量。未来的研究将集中于优化纯化技术，探索连续收获和灌流技术，以进一步提高产量，优化病毒颗粒-VG比例，降低rAAV载体生产成本。总结来说，我们开发了一种基于HEK293T悬浮细胞的rAAV生产系统，并使用基于DOE的方法来确定独特的生产参数，使我们能够实现多种血清型rAAV的高产量。

原文：H.Zhao, K.J.Lee, M.Daris, et al., Creation of a High-Yield AAV Vecotr Production Platform in Suspension Cells Using a Design-of-Experiment Approach. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, 2020, https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.06.004.