自扩增mRNA疫苗开发

本文节选自《An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development》，详细内容，请参考原文。

2019年12月起出现的SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)病毒可引起呼吸道疾病 - 冠状病毒病2019 (COVID-19)。该病毒已在全球蔓延，世界卫生组织(WHO)于2020年1月30日宣布其为国际关注的突发公共卫生事件，并于2020年3月7日正式宣布为大流行。全球一致认为，COVID-19疫苗可能是可持续控制COVID-19大流行的最有效途径，故而进行了前所未有的研究努力和全球协调，以迅速开发候选疫苗，并启动人体临床试验。这其中包括传统的疫苗技术，如病毒载体和含佐剂的亚单位疫苗，但我们见证了RNA疫苗领域的复兴以及向合成性RNA平台的转变。事实上，最早开始临床试验的疫苗之一是来自Moderna的一种非复制mRNA疫苗，mRNA1273；第一例患者于3月16日接种疫苗，与此同时，一项中国临床试验开始使用腺病毒-5型(Ad5)载体。此外，BioNTech/辉瑞的疫苗BNT162b2是第一个获得批准的COVID-19疫苗，首先在英国，然后是加拿大，其效力令人印象深刻，可达到95%。从那时起，已经有多个mRNA疫苗试验开始，并发表了相应的临床前和临床数据。

表1. mRNA COVID-19疫苗类型

伦敦帝国理工学院(ICL)，传统的非扩增信使核糖核酸(mRNA)，传统的碱基修饰非扩增mRNA (bmRNA)和自扩增信使RNA (saRNA)。

图1. 疫苗平台的比较，包括来自病毒本身和制剂为部分或完整改良版本病毒的疫苗的疫苗(左图)和核酸疫苗，如自我扩增RNA疫苗(右图)。核酸疫苗来源于对病毒基因组的了解，糖蛋白被编码成核酸，并通过合成载体(如脂质纳米颗粒)或惰性病毒传递系统(如腺病毒)传递。编码的抗原序列随后在宿主细胞内表达。

在之前的临床前和临床环境中，已经很好地描述了使用mRNA疫苗应对大流行的策略，但这是我们第一次看到这些平台应用于真正的大流行环境。mRNA疫苗的核心原理是在mRNA中编码抗原，然后使用非病毒传递系统将转录物递送到宿主细胞的细胞质，允许抗原表达并诱导抗原特异性免疫应答。这是一个特别有利的疫苗平台，因为mRNA疫苗可以生产针对任何已知蛋白靶点的病原体。mRNA是利用无细胞的酶转录反应生产的，这允许进行快速和可放大的生产，这一点从当前大流行中对RNA疫苗的追求就可以看出。目前，有三种主要的RNA疫苗：常规的、非扩增的mRNA分子(mRNA)，碱基修饰的、非扩增的mRNA分子(bmRNA)，其包含了化学修饰的核苷酸，以及自扩增的mRNA (saRNA或复制子)，其保持了源于RNA病毒载体的自复制活性。与非扩增RNA相比，自扩增RNA是有益的，因为它保留了mRNA疫苗的优点，如快速开发、模块化设计和无细胞合成，且由于自复制的特点，仅需要较低剂量的RNA。这可降低生产的负担，包括药物底物和产品，且对于大流行响应来说，还有潜在的优势，因其有可能在更短的时间内，对更多人进行免疫接种。

原文介绍了设计和开发saRNA的四个主要部分：抗原设计、载体设计、非病毒递送系统以及生产(包括saRNA和脂质纳米颗粒(LNP))。并讨论了过去5年内的主要创新和报告的临床前和临床数据，以及未来前景。

图2. 成功saRNA疫苗开发的4个主要部分。抗原、载体、递送和生产每个都代表了在成功药物产品开发中需要结合起来的模块化部件。每个部分都包括了一系列的设计和开发考量以及相关的技术。

图2. 促进saRNA疫苗和相关技术开发的创新时间表。这包括与成功的saRNA疫苗的四个部分中的每一个相关的技术进步。

生产

自扩增mRNA的生产

saRNA是使用酶转录法体外产生的，与传统短mRNA的产生过程类似，尽管需要优化反应条件，以提高此类更长的mRNA的产量。体外转录RNA的合成工艺在20世纪90年代已经建立，主要使用噬菌体RNA聚合酶，现在是一种稳健且成熟的合成型RNA的大规模生产方法。这种生产方法避免了与活病毒疫苗、重组亚单位蛋白质和病毒载体的细胞培养生产相关的复杂生产和安全问题。这是由噬菌体RNA聚合酶催化的酶反应，可生产数毫克量供研究使用的RNA的商业化体外转录试剂盒在几年前已经上市了。目前有多家合同开发和制造组织（CDMO）可提供制药级mRNA服务，如TriLink、Aldevro、Eurogentec、Biomay、Crative Biolabs，还有多家公司在不久的将来也能够实现该能力。目前还没有文献详细描述saRNA的大规模生产，但是图4描述了典型的无细胞RNA生产工艺中的单元操作。加帽的mRNA在生物反应器中以酶反应方式产生，DNA模板被消解。DNA片段、转录酶、试剂和副产物通过层析纯化以及之后的切向流过滤(TFF)去除。在TFF过程中，由于saRNA的粒径较大，选择合适截留分子量的膜可去除较低分子量的物质，RNA可以通过洗滤换液至适当的缓冲液体系并调节到所需的浓度。然后，RNA除菌过滤并批量储存，为进行进一步的下游工艺处理和制剂。

图3. 疫苗生产工艺的比较，包括传统疫苗基于鸡胚和基于细胞的生产，以及从病毒基因组序列信息生产的疫苗，后者包括分别来自Moderna、Novavax和Johnson& Johnsonde SARS-CoV-2 RNA、蛋白质亚单位和病毒载体DNA疫苗。RNA疫苗提供了一种无细胞的生产工艺，这使该平台具有诸多优点，包括允许进行方便且快速的疫苗生产。Moderna的SARS-CoV-2 mRNA疫苗（mRNA-1273）在发布SARS-CoV-2基因组后63天就开始了临床试验。*为进行比较，我们包括了以鸡胚和细胞培养生产的流感疫苗的时间线，但需要注意的是，此类疫苗不需要大型效力试验，因为它们的许可基于关联的保护性(血凝抑制(HI)抗体应答反应)。

图4. RNA药物底物的生产工艺示意图。该工艺包括无细胞的酶体外转录反应，然后纯化去除DNA模板，再以切向流过滤(TFF)置换缓冲液和浓缩，之后以0.2μm过滤器除菌过滤。

除了聚合酶外，体外转录反应通常包括：一个线性化的DNA模板，其启动子序列(~23个碱基)对响应的聚合酶具有高结合亲和力；四种必需碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的三磷酸核糖核苷酸(rNTP)；一种核糖核酸酶抑制剂，以灭活任何污染性的核糖核酸酶；一种焦磷酸酶，降解焦磷酸盐，后者会抑制转录；MgCl2，为聚合酶提供作为辅助因子的Mg2+；pH缓冲液，其也含有最佳浓度的抗氧化剂和多胺。如果使用共转录加帽，需要加入cap类似物，作为转录的引发剂。

重组质粒在大肠杆菌（E.Coli）中增殖，利用转录盒3 '端下游独特的限制性内切位点线性化，并使用标准的分子生物学技术分离和纯化。在体外转录反应中，噬菌体聚合酶结合启动子序列启动转录，然后酶沿着模板向其5 '端移动，在其移动过程中延长RNA转录物。转录终止发生在酶脱离模板的末端(转录中断)。多聚(A)尾可以被编码到DNA模板中，也可以通过酶的方式在转录后加入。当体外转录反应完成后，DNA模板用DNA酶片段化，然后用几种方法回收RNA，包括沉淀或层析。在体外转录反应中产生的RNA的质量和数量取决于许多因素，包括RNA转录物大小、模板浓度、反应时间和温度、Mg2+浓度和NTP浓度。通常，这些条件需要针对每种生产的结构类型进行一些优化。

虽然目前还没有大规模生产saRNA的公开报导数据，但以下章节中有关加帽、纯化、免疫刺激性副产物和稳定性的内容是工艺开发中应该考虑的领域。

saRNA加帽策略

体外转录(IVT) mRNA可以通过基于重组痘苗病毒的加帽酶的转录后修饰来加帽，也可以在体外转录过程中添加帽类似物。酶加帽更为复杂，但产量更高；加帽效率接近100%，所有帽结构都可在适当的方向上添加。酶加帽被用于大规模和实验室生产，可以产生帽0和帽 1结构。用帽类似物进行共转录加帽是制备IVT mRNA的另一种方法，其中在转录反应中提供过量的帽类似物。与酶加帽反应相比，这一过程要简单得多，但总产率往往较低，可能整合各种帽结构而导致更多样化的设计。假对称帽的历史问题现在已经使用抗-反向帽类似物(ARCA)解决了，其结果是大约70%的转录物带有帽0结构，30%带有5’三磷酸。为了提高加帽效率，已经引入了三聚体类似物，如CleanCap，它包含了帽1结构。对于saRNA的应用，还没有任何比较不同加帽策略效率的公开研究。

saRNA的纯化策略

mRNA具有一个带负电荷的磷酸二酯骨架，许多用于pDNA的纯化技术都可能适用于这种分子的纯化。DNA纯化技术包括：体积排阻层析(SEC)、反相色谱(RPC)、阴离子交换层析(AIEX)、疏水作用(HIC)和亲硫吸附层析(TOC)。对于常规的临床前工作和体内免疫研究，RNA可以沉淀。带负电荷的骨架的极性使RNA易溶于水，几种阳离子(使用最广泛的是氯化锂)结合冰乙醇作为共溶剂，可中和骨架电荷，降低溶解性，使RNA析出溶液。然而，在GMP生产中实施这样的工艺将是极具挑战性的。大小在10,000个碱基(MW ~3MDa)的自扩增RNA，与较小的传统mRNA相比还有额外的挑战，迄今为止还没有公开的、商业化可行的可放大的工艺，不过，很大程度上可能依赖于切向流过滤(TFF)等策略。关于RNA纯化的综述文章显示，许多技术可能会被利用，包括离子交换(IE)、亲和(AC)和SEC。因此，仍然需要一种针对saRNA的、优化的RNA纯化方法，且这种方法需能在工业规模条件下，实现具有时间和成本效益的纯化操作，达到高产量的制药级纯度，同时保持稳定性、生物学效力和RNA的功能。大规模的saRNA层析纯化是复杂的，也是许多公司和学术机构的一个重要研究领域。

免疫刺激性IVT反应副产物

理论上，加帽策略可能对疫苗效力产生正面或负面的影响，因为已知未加帽的RNA和不同的帽结构会触发抗病毒反应。saRNA疫苗作用机制研究表明，这可能导致潜在的效力降低，但没有公开的数据探讨加帽策略如何影响saRNA疫苗的效力的。

IVT反应产生的双链RNA（dsRNA）形式的副产物具有免疫刺激性。最近的研究发现，IVT反应中有两种主要的副产物，其导致了dsRNA分子的形成。第一种是通过脱离产物的3’-延长退火到脱离转录物中的互补序列形成的，可以是顺式(在同一RNA分子上折叠)，也可以是反式(退火到第二个RNA分子)，从而形成延伸的双链。第二种类型的dsRNA分子是由反义RNA分子与脱离转录物杂交形成的，由与启动子无关的转录起始产生。使用离子对反相高效液相色谱法可从常规碱基修饰的mRNA中去除dsRNA，但这种方法不具有可放大性，乙腈洗脱液的毒性很大，且没有证据表明它对saRNA有效。一种更好的方法，尽管没有用dsRNA测试过，是在含乙醇缓冲液中，将dsRNA选择性结合到纤维素。另一种方法是，如最近所述，将高温IVT与模板编码的多聚(A) 尾结合生产mRNA。这一过程可减少两种dsRNA副产物的形成，产生低免疫原性的功能性mRNA。值得注意的是，这些技术都没有用于更大的saRNA过。理论上，dsRNA的存在可能对疫苗效力产生正面或负面的影响，因为已知dsRNA可以触发抗病毒反应。saRNA疫苗的作用机制研究表明，这可能会降低效力，但目前还没有公开的数据探讨dsRNA的存在如何影响saRNA疫苗的效力的。

mRNA的稳定性

DNA和RNA在稳定性方面有很大的差异。经过20多年对pDNA疫苗的广泛研究和开发，已经研制出一种设计合理、在30℃条件下可稳定使用1年的液体制剂方法。这种稳定性在mRNA疫苗中是不可能的，因为RNA的核糖上含有2’ 羟基，这比脱氧核糖的水解稳定性差得多。根据理论计算，“裸”的4000核苷酸的mRNA在原液(PBS、pH 7.4、没有Mg2+)中的5℃稳定性估计为半衰期900天。然而，温度上升到37℃预计将导致半衰期缩短为5.4天。较长的自扩增mRNA (12 kB)被计算为加剧水解(高3倍)，在5 ℃下的半衰期为314天，在37℃下的半衰期为2天。

在生产过程中(IVT反应和下游工艺)，mRNA受到高浓度Mg2+和高温的影响，这些因素都需要缓解，以限制水解。降低mRNA水解的一个基本未被探索的策略和理论基础是重新设计RNA，以形成双链区域，保护其不受直线切割和酶降解，而可编码相同的蛋白质。

RNA比DNA对氧化、烷基化或亲电加成反应更敏感，这些反应会导致糖苷键的水解。此外，RNA容易被三种主要的RNA降解酶(核糖核酸酶或RNase)降解：内切酶(在内部切断RNA)、5’外切酶(从5’端水解RNA)和3’外切酶(从3’端降解RNA)。因此，saRNA产生后通常需在-80℃条件下储存，并小心避免引入RNase。储存RNA的最佳pH值为pH = 4 - 5，因为RNA在pH值为> 6时容易发生碱性水解，而酸水解仅在pH < 2时发生。

在肌肉注射疫苗后的递送过程中，由于存在高水平的Mg2+离子和37℃的体温，以及RNase降解，saRNA容易水解。包封在LNP的方式已经被证明可限制酶降解，但是应该注意的是，如果脂质的阳离子头基降低了核糖2’羟基的pKa，那么包封在脂质制剂中的saRNA可能会增加水解。

制剂的mRNA药物产品的生产考虑因素

制剂的mRNA药物产品的制造和生产过程可以因制剂的类型而有很大差别，一个临床相关的生产工艺可以归纳为四个步骤：(1)制剂，其中包括一个或多个混合步骤，(2)下游工艺和纯化，(3)通过0.2μm过滤器除菌过滤，(4)灌装。关于目前正在进行临床试验的候选saRNA疫苗的特定生产工艺的公开信息很少。因此，每种剂型的临床前工艺将从此前关于脂质纳米颗粒和纳米乳的文献归纳而来。为了专注于潜在的临床生产，相比固定体积的工艺，更青睐于可放大的连续流工艺步骤。

图5. 非病毒saRNA输送系统。基于脂质、聚合物和乳剂的递送系统均使用阳离子基团来介导阴离子RNA的缩聚以及跨细胞膜递送。LNP系统已经被发现是最有效的疫苗制剂，它利用pH敏感的离子化阳离子脂质，并通过受体介导的细胞内吞作用被细胞摄取。在核内体中，低pH环境电离阳离子脂质，然后与核内体膜中的阴离子脂质静电相互作用。这些离子对引起相变，形成多孔六边形相(HII)，破坏核内体，促进RNA释放到细胞质。

脂质纳米颗粒的生产

Anderluzzi等人证实了NanoAssemblr微流控混合器的通用性，通过连续流动溶剂/反溶剂沉淀方式生产各种saRNA制剂，如脂质体、固体脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒。Lou等人也证实了同样的平台可用于带有可电离LNP的saRNA制剂。该技术已被建立用于生产其它RNA-LNP制剂，包括碱基修饰的mRNA疫苗。这一过程包括将含有溶解脂类或聚合物的水溶有机溶剂与含有溶解saRNA的水相在优化的流速和有机/水流速比下快速平流混合，以控制沉淀条件。当使用可电离阳离子脂质时，含有溶解的saRNA的水相在pH值低于可电离脂质的pKa时被缓冲。saRNA-LNP制剂也可采用其它在线混合方法，包括可选微流控体系结构以及T型管在线混合。切向流过滤是一种高通量的过滤方法，可用于去除溶剂，并调节最终浓度。

纳米乳的生产

阳离子纳米乳液采用两种不相混溶的相，因此需要不同的生产方法。文献中描述的工艺一般包括将阳离子脂类和疏水表面活性剂溶解在角鲨烯中。将得到的油相与含亲水性表面活性剂的弱酸性缓冲液混合，形成初级乳状液。然后，初级乳状液反复通过高压均质机，以获得更均匀的纳米乳状液。将得到的乳状液与saRNA混合，并在4 ℃下孵育30至120min。然后通过0.2μm过滤器对制剂进行除菌。高压均质已被用于针对药物递送的、基于脂质的胶体的大规模生产。

总的来说，通过共转录加帽和层析纯化去除双链RNA，以及可获得可重复颗粒批次的微流控系统，可精简RNA制剂的大规模生产流程。

原文：A.K.Blakney, S.Ip, A.J.Geall, An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development. Vacciens, 2021, 9, 97.