用于极高细胞密度培养液的抗体捕获工艺：基于磁珠的方法

本文节选自《Antibody capture process based on magnetic beads from very high cell density suspension》，详细内容，请参考原文。

在单克隆抗体(mAb)等生物制药产品生产中，细胞澄清是通过极高细胞密度而实现强化的工艺的主要挑战。本研究提出了一种简化的方法来解决这一难题，即使用偶联Protein A的磁珠，在单个步骤中完成细胞澄清和mAb捕获。此外，从未澄清的CHO细胞悬液中捕获mAb的实验显示出了令人满意的结果，然而，它还没有被证明可以处理在强化补料分批培养中观察到的极高细胞密度的挑战。本文研究了基于磁珠的mAb捕获对强化补料分批培养获得非澄清细胞悬液的性能。从密度大于100 × 10⁶cells/mL的培养液中进行捕获，吸附率为99%，总收率为93%，宿主细胞蛋白(HCP)清除对数≈2-3，HCP浓度≤5 ppm。这些结果表明，从极高细胞密度的细胞悬液直接进行捕获是可能的，而不需要预先处理。该技术在降低操作成本和提高性能方面带来了显著的好处，如低HCP，可以成为缓解工艺强化挑战的强大工具。

作者提出了一种基于磁珠的纯化方法，可以从极高细胞密度(>100 x 10⁶ cells/mL)的强化补料分批工艺获得CHO细胞中直接捕获mAb。从吸附、洗脱和极低的最终HCP含量考虑，从非澄清的细胞悬液中直接进行捕获的方法具有良好的性能，尽管细胞密度极高。与传统的细胞澄清及随后的捕获操作相比，该工艺在操作时间、耗材和工作量方面有了显著的节省，同时为细胞提供了非常温和的条件。

简介

基于培养基更新的强化细胞培养工艺在过去十年中获得了行业极大的兴趣。不同的方法，如在N-1阶段使用灌流技术提高接种细胞密度、稳态灌流操作或结合了补料分批和灌流模式优势的混合生产工艺，均可显著提高单位体积单抗产量。本报告集中讨论后一个概念：强化补料分批，也称浓缩补料分批，其是使用基于超滤过滤器的细胞截留装置的培养基更新工艺，可以在生物反应器中实现非常高的细胞浓度和产物积累，例如，滴度超过25 g/L，细胞密度超过200 x 10⁶ cells/mL。这种工艺或稳态灌流的非常高的细胞生物质含量对细胞澄清步骤造成了严峻的挑战。通常情况下，由于设备和/或耗材的成本及其时间密集型性质，导致这一步的操作成本非常昂贵，且有可能由于细胞裂解而导致宿主细胞蛋白(HCP)水平的增加。在极高的细胞密度条件下，离心和过滤方法将达到其去除固体颗粒能力的极限。离心技术能够在处理固体颗粒含量较高的料液，但即使是密闭式离心机也会产生显著的细胞破坏，从而降低澄清效率并导致产物降解。此外，对于离心后进行、去除固体颗粒的深层过滤，进样液流也会产生不小的挑战，如导致过滤器堵塞或过滤器不良的利用率。为了优化细胞澄清步骤，可以采用低pH和絮凝剂对进料液流进行预处理。这些预处理操作可以得到更好的澄清效果，但缺点是会在培养液中添加新成分，或形成不适合后续捕获步骤的低pH值。高细胞密度培养的细胞澄清一直是生产的瓶颈。

在细胞澄清后，使用Protein A柱层析进行的捕获步骤是单抗纯化的金标准，因其对这些蛋白有极高的亲和性。然而，这一步也代表了另一个瓶颈。Protein A柱层析的性能很难与强化细胞培养获得的产物相匹配。柱层析捕获步骤的主要缺点是上样和漂洗阶段时间长以及需要获得无细胞的上清液。

使用磁珠的分离，“磁性分离”，是一种众所周知的技术，并已作为分析工具使用了几十年。最近，磁性分离作为传统纯化技术的替代选择而用于纯化工艺引起了行业不断增加的兴趣。这种兴趣是由其有利的特性所激发的，如以一种对细胞温和的方式，快速且高处理量地处理整个细胞培养液。磁性分离通常需要功能化的磁珠和磁性过滤器。Protein A功能化处理的磁珠结合了两方面的优势，即磁性分离以及这些配基对单抗的高亲和性。这种组合使得从非澄清的细胞培养液中直接捕获单抗成为可能，在之前的一份报告中，已在中试规模上证实了其可处理高达14 x 10⁶ cells/mL的培养液。磁性分离捕获步骤已应用于不同的粗培养液，然而，据我们所知，尚未发表关于从强化补料分批培养中获得的非澄清高细胞密度培养液中捕获单抗的挑战性任务的报告。集成了细胞分离和目的产物捕获、且可直接应用于高密度细胞培养液的磁性分离单步骤工艺，在节省操作时间、耗材和工作量方面，具有极大的潜力，同时为细胞提供温和的条件。

本研究的目的是提供一种概念证明，即证明极高细胞密度的未澄清细胞悬液的磁珠单抗分离工艺的可行性。特别是，我们的目标是将这种技术应用于强化的补料分批工艺，后者使用基于中空纤维超滤过滤器的灌流技术，已知这种方法获得的细胞培养液对于澄清操作非常具有挑战性，并且是展示磁性分离潜力的一个极好的挑战，包括操作步骤的显著简化。在这里，我们的目标是针对来自未澄清的高细胞密度培养悬液的mAb捕获步骤，维持高产物收率，其纯度与传统的细胞澄清加柱层析的方法相当或有所提高。

材料和方法

强化的补料分批培养

强化的补料分批培养在200mL工作容积的玻璃搅罐DASbox生物反应器(Eppendorf)中进行，灌流操作使用交替式切向流XCell ATF 2 (Repligen)细胞截留装置，结合MWCO 50 kDa的超滤中空纤维过滤器(UF-HF)。实验分别进行3次培养cult_01、cult_02和cult_03。cult_01和cult_02的过滤器为F2:RF50PS，膜面积0.14 m2 (Repligen)。cult_01是用于测试该技术的初步培养，其使用的过滤器在以前的运行中已经使用过，但进行了清洗。cult_03使用RTPUFP-50-C-4MS过滤器，膜面积为0.065 m2(Cytiva)。使用MWCO 50 kDa的UF-HF进行灌流可置换掉所有低分子量组分，而大分子被过滤器截留在生物反应器中，从而可使抗体累积。实验使用BalanCD CHO Growth A培养基，添加5% BalanCD CHO Feed4 (FUJIFILM Irvine Scientific)、100 mg/L链霉素和60 mg/L青霉素G (Sigma Aldrich)，组成补液培养基。cult_01和cult_02以5 ×10⁶ cells/mL接种，当天开始灌流；cult_03以1 × 10⁶ cells/mL接种，第2天开始灌流。灌流速率从0.5VVD开始，随着细胞密度逐渐增加，直到第10天，之后，run_02和run_03的细胞特异性灌流速率(CSPR)分别设置为50 pL/cell/day和20 pL/cell/day。葡萄糖和谷氨酰胺根据细胞需要补充。温度设定值为37℃，溶氧浓度为40%，pH值为7。在预先设定的时间点或因UF-HF阻塞而导致灌流操作障碍时结束培养，并进行捕获步骤。

其它操作，包括使用磁性Protein A琼脂糖珠进行mAb纯化、工艺分析、体积排阻层析、电荷异构体分析、N-糖基化分析、CHO宿主细胞蛋白的ELISA分析等，请参考原文。

3个强化补料分批培养 (cult_01、cult_02和 cult_03)培养数据。(A)总细胞密度和活性随培养时间的变化趋势。(B)生物反应器中单抗浓度与培养时间的关系。cult_02和 cult_03中获得的细胞密度及单抗产量的差异的原因是，cult-02在达到59.4 x 10^6cells/mL后，开始细胞废弃（Cell Bleeding），以维持该密度，而在cult-03中，不进行细胞废弃，让细胞密度自由增长至119 x 10^6 cells/mL，直至过滤器堵塞。

磁性纯化方法直接应用于收获的细胞悬液；吸附率随残留在细胞悬液中的游离mAb的时间的延长而降低(左图A、C、E); 2小时后的总结合及总洗脱收率（左图B、D、F）。(A -B) run_01的吸附率，mAb浓度为0.8 g/L，总细胞密度为17.5 x 10^6 cells/mL。(C-D)run_02的吸附率，mAb浓度为6.6 g/L，总细胞密度为56.8 x 10^6 cells/mL。(E-F) run_03的吸附率，单抗浓度为10.9 g/L，细胞密度为103.9 x 10^6 cells/mL。

详细实验结果和讨论，请参考原文。

总结：

对单克隆抗体的需求日益增长，给生产带来了越来越大的负担。上游工艺的发展已经可以达到非常高的细胞密度和mAb滴度，继而对下游工艺提出了挑战。极高细胞密度的培养液含有大量的颗粒，粘度比培养基大得多，这对初步回收，即离心和过滤，是一个主要的挑战。在此之前，要么使用絮凝方法，加入化学剂，然后进行纯化，或者稀释细胞悬液。这些都不是最佳的选择，会导致工艺时间延长，增加成本，且可能导致产物损失，并使mAb暴露在严苛的机械条件下，潜在地导致聚集形成，有时还会导致蛋氨酸或色氨酸的氧化。因此，一种更精简且更高效的替代方法，以进行细胞澄清和之后的mAb捕获步骤，尤其是对于极高细胞密度的培养液来说，是非常有利的。本研究所提出的磁性分离技术，结合了细胞去除和基于磁珠的捕获，表现出了优异的性能，并能应对上述对下游工艺的沉重负担。在目前的研究中，证明了在高粘度细胞悬液中的极高浓度的细胞和颗粒对mAb磁性分离性能和操作时间没有任何影响。该工艺具有较高的mAb吸附率(98 ~ 99%)，总收率可达94%。HCP的降低与Protein A层析相当，为2-3 LRV，但重要的是，在磁性分离过程中对细胞的去除非常温和，因此最终的HCP非常低，在100 × 10⁶ cells/mL的细胞浓度条件下，HCP在0.6 ~ 5ppm之间。本研究首次从密度大于100 x 10⁶ cells/mL的非澄清细胞悬液中直接捕获了mAb，并证明了该工艺在纯度和收率方面具有良好的性能。以往对这种工艺进行规模放大的经验也表明，这是一种非常有吸引力的生产替代方案。

原文：N.Brechmann, H.Schwarz, P,Eriksson, Antibody capture process based on magnetic beads from very high cell density suspension. Biotechnology & Bioengineering, 2021.