慢病毒载体内部技术转移和成功生产的关键

---

本文节选自对Eureka Therapeutics法规科学家Nicole Nuñez (NN)、工艺开发研究助理Liam Powers (LP) 的专访。详细内容，请参考原文。

问:你们现在在做什么?

NN: Eureka目前正在建设位于湾区的新GMP工厂。这将适应我们的慢病毒载体和T细胞治疗产品的生产。

此外，我们还致力于制定针对慢病毒载体的监管策略。我们最近为我们的慢病毒生产工艺向FDA提交了一份主文件。它已经被监管当局接受，并且有可能支持我们未来所有的T细胞计划。

LP：我的工作主要集中在慢病毒和T细胞治疗工艺的开发。我的一些实验关注的是T细胞转导，但同样，我的很多工作涉及如何开发一个精确、准确且可靠的生物分析方法，以确定慢病毒载体的效力。

问:你们能告诉我们更多关于Eureka慢病毒载体制造的方法吗?它与目前细胞免疫治疗领域的其它研究有什么不同?

NN：我们已经花了相当多的时间和精力来确保我们的质粒设计和生产工艺能够产生高滴度和最大产量，这意味着我们可以限制所需的生产规模。

对于依赖病毒载体的生物技术公司，特别是将其作为细胞治疗生产中的试剂来说，这种载体往往被视为工艺中的瓶颈。因此，我们自己开发了自己的专利工艺，消除了对外部载体CMO支持的需要。这使得Eureka对工艺有了更大的控制，更快的周转时间，能够满足需要载体的新项目，最重要的是，我们可以按照自己的时间表做所有这些事情。

LP：我们的总体方法是自己控制整个流程的各个步骤，而不是依赖许多不同的合作伙伴。这需要我们在前期投入大量的精力，并花时间优化我们自己的工艺。

这方面的具体研究领域包括质粒优化 -确保质粒能够适应转基因，找到效果更好的不同组合 -以及优化转染和收获步骤。此外，我们已经优先考虑了制备自己的细胞系的能力。最后，正如Nicole提到的，我们在监管方面建立了必要的知识，使我们能够在这方面独立运作。

问:迄今为止，你们在慢病毒载体生物工艺开发中面临的主要挑战或瓶颈是什么?你们是如何解决这些问题的?

NN：我们发现的一个问题或瓶颈，同样主要与CMO工作有关，那就是产量不可靠。你可以使用两家不同的CMO，得到完全不同的产量，这取决于它们的工艺。当我谈论产量时，实际上是指功能性滴度，因为很明显，在大多数情况下，有可比较的方法来测量和定量物理滴度，例如通过p24ELISA。然而，这并不能告诉你到底有多少活的慢病毒颗粒存在。

我认为这是一个小小的痛点。有时很难评估一个CMO以及它们的病毒载体如何“处理”你的转基因。它是如何生产的，你最终会有足够的产品用于你的临床研究吗?

LP：在缓解瓶颈方面，我认为从贴壁细胞系到悬浮细胞系的转换是我们第一次扩大规模的主要原因。

问：在当前疫情严峻的环境下，确保技术转让成功的关键是什么?

NN：Liam和我都领导了我们的慢病毒载体项目向GMP领域的技术转移。关键是多个部门的相互合作 - 与我们的工艺开发团队、生产、质量控制、质量保证、监管、合同、财务和我们的领导团队密切合作。所有这些都有助于我们的计划和执行，使我们能够成功地启动我们的GMP慢病毒生产项目。

当你在进行技术转移时，很多工作都围绕着确定差距和进行风险分析 -当然，最好是在差距成为问题之前 - 并试图确定我们现在需要解决什么问题，以及我们下一步需要解决什么问题。

我认为我能给其他参与这种技术转移过程的人的最大的启示或建议之一，就是记录下你的每一次谈话，关于你的制造、你的质量控制策略、技术转移以及工艺开发等等。你永远不知道什么时候，哪怕是最小的讨论也会再次出现，如果他们真的出现了，你真的会感谢自己勤奋地记录下自己做出这些决定的原因。

很明显，GMP的好处是你总是记录一切。但是当你们处于GMP的上游 - 在技术转移、工艺开发，甚至是在研究中 - 当你们进行这些早期对话时，你们也应该始终记录它们。并不是说文档在早期阶段就树立了先例。很重要的一点是要记下来为什么你决定改变这个过滤器，为什么你决定做这个QC实验而不是那个，等等。之后，当你去参加一个会议，或者一个监管机构带着这些问题来找你时，你会得到一个已经相当充实的答案，因为你已经想过这些问题了，即使是几年前。

LP：我认为Nicole是完全正确的。有很多不同的因素，我们都试图把它们结合起来，以实现成功的技术转移。

我认为真正帮助我们取得成功的是我们拥有一个专注于技术转移的小型专业团队。它的主要特点是灵活性和敏捷性，因为会出现不同的问题，有时你必须迅速作出反应。

与此同时，这个专注的团队让我们能够与GMP工厂的员工保持真正密切的工作关系。我真的觉得我们培养的关系和我们双方之间的密切沟通真的有帮助整个事情顺利地进行。事实上，我认为这种关系可能是技术转移中最重要的事情之一 - 当然，除了所有工艺方面之外。

问:最近生物工艺和分析工具方面的哪些发展对你们最近的工作影响最大?你们希望在这方面看到进一步的创新吗?

LP：在我们的工艺开发中，我们并没有把太多的注意力放在结合最近开发的分析技术或工艺技术上。这是因为对于测试和建立一个好的工艺，我们主要依靠我们的功能性滴度测定方法，我不认为有任何替代技术可以真正比较。

但就未来的创新而言，我希望在慢病毒载体领域看到的是，不同的主要参与者可以聚在一起，形成一种既定的方式来解释什么是转导单元。目前，不同的实验室之间存在着如此多的混淆，无论是他们各自如何测量它，还是如何将结果从一个实验室传递到另一个实验室。我想，如果每个人都能同意一种标准的方式，这将有助于我们所有人在未来的特定领域进行创新。

NN：我赞同Liam关于这一领域需要标准化的评论，这让我想起了我之前所说的在评估CMO进行载体生产时所面临的挑战 - 没有一个指导方针或通用的方法。所以我认为在开发工艺和最终评估工艺上都需要花费大量的工作，因为最终，这些将是你未来用于病毒载体QC放行的检测方法。

LP：我也认为这些基因治疗载体的生产规模要求与工具供应商目前提供的产品仍存在差距。很多工具主要是针对大规模生产的抗体或其它生物制品。如果供应商能以更适合的规模生产产品 - 例如，每批生产2升到20升 - 这可能会帮助其它像Eureka这样的小公司起步。

问：慢病毒载体的最佳分离/纯化系统应该是什么样的?

LP：就整个流程而言，我只想说处理时间是关键 - 您会希望尽可能缩短处理时间，因为病毒在整个过程中不断退化。理想情况下，从培养收获到装瓶一天内完成是最好的。我认为完全自动化的系统将有助于创造这种情景。

就纯化而言，我认为超滤是最重要的一步。这可以完成所需的大部分分离，尽管对于某些需要高纯度等级的应用 -例如注射 - 你还需要增加层析步骤。

我们还认为应该需要在最后进行除菌过滤步骤，因为它降低了风险，并将提高您的批次间一致性。

问:最后，你们能否总结一下您自己和Eureka Therapeutics未来12-24个月的主要工作目标和优先事项?

NN：就EurekaTherapeutics整体而言，我们的主要目标是通过使用我们的先导T细胞治疗产品治疗肝癌适应症的临床研究，以获得概念验证的临床数据，当然，这部分依赖于我们慢病毒载体的成功生产。

就我个人而言，我最近从一名工艺开发科学家转变为一名监管科学家。我将专注于生产和QC工作与监管领域的交叉部分，监管文件编写、提交、与FDA的沟通以及病毒载体主文件的管理，等等。

相对而言，这仍然是一个新的领域，它在不断地发展。说到监管机构，真的很难预测他们想要什么，什么时候想要。每当有关于某个病毒载体产品的安全问题的新闻稿或新闻报道出现时，我相信你应该总是停下来，暂停，然后真正地看看你自己的病毒载体工艺。问问自己，这种情况是否适用于我们，如果适用，我们是否有适当的风险缓解措施?我认为你总是需要在监管方面向前看。

监管环境将继续发展，我认为重要的是，公司要花相当多的时间来考虑他们的战略，并认识到不是公司的每个病毒载体项目都适合向前发展。

LP：对我来说，将继续支持和发展我们在临床试验和GMP生产方面的能力。

原文：N.Nuñez, L.Powers, Keys to success for in-house lentiviral vector tech transfer and manufacture. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(3), 379–385