一次性生物反应器中工艺规模放大的策略和考量
The following article is from 多宁生物科技 Author 才华多多
一次性生物反应器正越来越多地被用于基于动物（如哺乳动物和昆虫）以及人类细胞的生产过程。它们特别适用于高价值产品的生产，以及其它需要快速、安全生产的情况。一次性生物反应器在筛选研究、细胞扩增以及产品表达方面已经确立了自己的地位，包括治疗性抗体、预防性疫苗以及基因/细胞治疗产品的临床前和临床样品的供应以及商业化规模的生产。
如果一次性生物反应器选择得当并操作正确，与可重复使用的生物反应器相比，可以实现更灵活、更安全、更环保、更便宜且更快的生产过程。事实上，生物反应器接种前的蒸汽灭菌以及昂贵、耗时且费力的清洁程序已经是一种“过时”的运营策略。一次性生物反应器袋子已预先组装且经过辐照，由供应商以即取即用的形式交付。验证清洁过程的需求以及多产品生产工厂中交叉污染的风险也可随之降低，这使得产品轮转更加灵活和快速，并降低成本。
生物反应器的基本组成、种类以及
一次性技术选择
控制器
控制器是生物反应器平台的“大脑”，其主要功能是监测和控制反应器罐内的关键过程参数，例如pH、温度、溶氧以及可能的培养基置换。反应器能够针对指定的过程参数控制元件提供输出，以纠正这些参数值与用户定义的设定点之间任何偏差。可以监测和控制的参数数量取决于并入生物反应器罐中的传感器和控制元件的数量。
图为多宁生物DuoCubactor一次性生物反应器控制器及操作界面
罐体
选择罐体时首先要考虑的是选择最适合工艺的材料：塑料（一次性使用）、玻璃或不锈钢。针对特定工艺的选择取决于多方面的影响因素。玻璃罐是较为灵活的小体积应用选择，其可以对导管进行修改和调整，然后可以通过高压灭菌对整个反应器进行消毒。一次性容器的设置速度最快，不需要清洁或灭菌，并且在大多数体积规格条件下都可以轻松使用。而当体积需求特别高而无法选择一次性产品时，可使用不锈钢罐。
图为多宁生物南京罐体生产工厂效果图
摇摆式生物反应器
摇摆式生物反应器是由放置容器的平台组成一类反应器，其通过电动机提供围绕一个或多个轴的运动。在许多工艺中，摇摆式生物反应器的主要优势是为细胞提供低剪切环境，因为它们不会直接暴露在快速移动的叶轮叶片尖端。此外，在摇摆式生物反应器中更容易在大工作体积下实现良好的气体混合，而无需通过鼓泡喷入培养基。
图为多宁生物DuoWave反应器（点击图片了解更多）
一次性搅拌罐生物反应器
搅拌罐生物反应器包含位于反应器中心的叶轮。这些叶轮可以安装在垂直轴上或直接安装在容器底部，也有一些新型叶轮类型，其旋转轴不是严格垂直的。搅拌罐生物反应器是最广为人知的生物反应器模型之一，已在单抗生产中成功使用了二十多年，也是行业内最广泛使用的生物反应器类型。
图为多宁生物DuoCubactor一次性生物反应器 （点击图片了解更多）
选择合适生物反应器类型的决策标准
最适合所需应用的生物反应器的选择取决于多方面的因素，包括i）培养任务：生物质或细胞生产、生物活性物质的表达; ii）生物反应器的工程参数，其与产品数量和质量密切相关；iii) 计划的生产规模；iv) 生产的有机体及其形态和生长、生产行为；v) 法规要求，如生物安全和 GMP 合规性；vi) 基础设施条件；vii) 专有技术人员；以及 viii) 投资和运营成本。如果要在最佳条件下培养植物细胞和组织培养物或需氧微生物，则生物反应器的选择将仅限于预先设计的特殊类型，而在选择适用于动物细胞的生物反应器时，则可选项最多。对于一次性生物反应器，不可低估的选择因素还包括供应商的服务以及其确定用于反应器袋子的薄膜材料的影响，应在设备选择的早期阶段识别薄膜通过吸附疏水成分和/或可析出物迁移而损害细胞生长的影响。
选择合适一次性生物反应器的标准 (V.Jossen, et al., 2019)
一次性生物反应器的规模放大考量
在生物反应器中进行细胞培养时，可放大性是最重要的考虑因素之一。对于患者群体规模较大的适应症，可能需要工作体积为100–2,000 L 甚至更大的生物反应器来满足市场需求。而对于研发、工艺开发和临床前/早期临床试验，从产量和成本的角度来看，可能不需要如此大规模的操作。因此，了解将生物反应器平台从研发和早期临床试验中使用的小体积（例如，1-10L）扩大到商业化规模生产中使用的更大体积（例如，100–2,000L）而不显著改变培养物的动态或细胞生物学特性至关重要。在选择生物反应器平台以及规模放大或缩小时，应考虑小规模和大规模生物反应器之间培养参数和平台部件的可放大性差异。因规模放大而改变的参数包括剪切应力、氧气传输速率（包括从基于顶部空间的气体供应转变为鼓泡的方式转变）、使用消泡剂的必要性等。这些差异应尽量减少并慎重考虑。缺乏对可放大性的关注会导致细胞的生长动力学、细胞生物学和产物关键质量属性发生变化，继而导致工艺无法放大。
在为细胞培养工艺选择和评估规模放大和缩小反应器系统时应考虑的物理参数包括：
反应器几何结构 单位体积氧传质系数KLa 最高剪切应力 单位体积液体输入功率Pg/V 单位体积液体的气体流量QG/V 表观气体速度 混合时间 叶轮Reynolds数 动量因素
反应器的几何结构基于已知的规模放大经验，这推动了具有类似几何形状的反应器开发。反应器的几何形状包括高径比以及叶轮与罐直径的比值。kLa标准是最常用的，因为有氧培养的性能通常受限于氧气供应。恒定的kLa确保在不同规模的操作中具有相等的氧转移率。哺乳动物细胞通常对剪切非常敏感，因此保持非致死水平的剪切应力可确保细胞不会遭受过度损伤而影响其活性和产物生产。Pg/V与体系内的剪切密切相关。在一些培养研究中，相等的Pg/V被用作剪切敏感工艺的规模放大参数。单位体积液体的气体流量以及表观气体流速与有氧培养中使用的通气率有关。两者都为生物反应器中的氧气输送提供条件，但也会对细胞产生剪切损伤。最后，其它参数与系统中的传质问题以及剪切敏感性有关。
大规模细胞培养中常见的典型限制 （D.M.Marks, 2003）
这些参数的差异性在不同规模之间应尽可能地最小化，并且在规模放大时必须仔细检查这些参数的变化对细胞生物学和关键产品属性的影响，以免改变产品属性或导致对产品效力影响。强烈建议遵循质量源于设计 (QbD) 方法，其中工艺参数的设计空间和操作空间需在工艺开发阶段的早期建立，并考虑和理解关键工艺参数及其偏差对产品关键质量属性的任何影响。
工艺规模放大的关键方面包括：
规模放大应谨慎进行，并尽量减少对细胞环境造成物理化学变化 考虑到要治疗的预期患者规模和预期剂量范围，应尽早选择和实施“正确”的平台。 必须深入理解和跟踪由于规模放大和工艺变化（包括材料）引起的物理化学变化。 必需尽可能了解产品的作用机制。 开发相关且可靠的分析方法，以评估关键产品属性，首要的是效力分析。 应连续使用一系列相关检测，来评估整个工艺变化和规模放大过程中的细胞和产物，并进行不同生产规模之间的可比性研究，以确保产物保持关键属性。
使用小规模细胞培养平台来研究细胞并优化生产部件和工艺是非常有效的策略，例如，培养基成分、补液速率、生长因子添加、细胞-表面和细胞-细胞相互作用等，在条件允许的情况下，推荐使用基于多联罐的高通量实验设计（DOE）方法。在许多情况下，正确的研发方法可能对提高细胞质量和降低最终商品的成本极为有利。
在最好的情况下，规模放大需要在发生变化时仔细检查细胞特性和生物学。要了解工艺及规模变化对细胞状态和产物效力的影响首先是了解每种疗法在特定临床适应症背景下的作用机制。相关的环境变化包括构成细胞环境的各种物理化学状态，包括培养基成分、渗透压、pH、溶解气体组成、细胞-细胞相互作用、剪切应力等。由于规模放大导致的环境或工艺变化可能对某些细胞类型是“致命”的。针对治疗产品作用机制的良好理解可以帮助评估工艺变化是否对产品关键属性和效力产生影响。
重要的是要记住，确保细胞在整个临床试验过程及以后的商业化生产过程中表现良好且一致，这首先符合生产商的利益。由于规模放大及与其相关的工艺变化而导致关键细胞培养属性的改变可能导致临床试验失败。更严重的是，影响产品关键质量属性，且因为不知道根本原因而导致无法补救。这突显了对产品作用机制以及与该机制直接相关的体外和体内分析的完整理解的必要性。随着工艺的放大，这些分析反过来又可以用来持续评估细胞及产物的关键质量属性。一旦检测到显著变化，可以立即返回查看工艺变化，是否确实对细胞产生了不利影响，并设计解决方案来解决这个问题。
最后，某些因素与高细胞密度培养有关。例如，培养基的pH值通常通过碳酸氢盐和溶解的CO2的缓冲体系而在细胞培养中维持。然而，在高细胞密度下，由于酸性代谢物和CO2的释放，培养会变成酸性。缓冲能力可能变得不足以维持所需的pH值，可能需要以低体积添加的浓缩碱溶液。此外，对于高细胞密度培养物，表面通气不足以为细胞提供足够量的O2，需要通过鼓泡直接通气。然而，鼓泡会导致大量气泡的产生，并且在培养物表面处或附近的气泡破裂可能导致细胞裂解和蛋白质变性。特别是，鼓泡喷气进入含有高蛋白质含量的培养基，例如添加血清的培养基，会导致过度起泡。因此，可能有必要根据需要添加消泡剂以避免或至少降低起泡。鼓泡通气的另一考量是微泡和大泡的选择或组合，即在高细胞密度条件下保持氧气供应的同时，降低上述对细胞的损伤，而且，不同规模或类型的生物反应器可能有不同或缺乏这样的配置规模，需在工艺开发以及规模放大时仔细考虑。
在生物药产品的开发进程中，规模放大以及与其相关的工艺参数变化是必要且不可避免的。由此产生的可比性研究很重要。如果尽可能地减少变化，正确完成，并在整个工艺开发过程中监控细胞以及产物属性，适当地设计和进行可比性研究，可以克服或尽可能缓解各个相关风险。
稳定供应链
近年来，对生物制药生产和生物工艺的最大影响因素可能就在于新冠病毒的大流行及其对经济和社会等各方面的干扰，尽管行业通过快速调整适应以及加速已有趋势而实现了积极的响应，但是挑战依然存在，特别是生物治疗药物因加快的开发时间线压力而产生的对相关设备和耗材的迫切供应需求，加上因疫情防控等因素而导致的人员短缺和物流挑战，在当前的时间点，供应链问题仍未完全解决。而稳定的生物工艺原材料供应是生物制药和生物技术公司确保产品开发以及顺利进入临床直至商业化的关键。多宁生物提供全系列的生物反应器产品，包括各个规模的硬件设备和相应耗材，结合本地化生产的优势以及积极复工复产的举措，旨在确保安全、稳健且高质量的产品供应。
总 结
在快速增长的生物制药市场中，大规模生产对于生产的经济性至关重要，规模放大是将产品带入商业化阶段的关键步骤，然而，这个过程如果控制不当也经常会导致开发和上市的延迟以及经济和性能的损失。该过程通常会涉及流体动力学条件的变化，而合理的规模放大/缩小策略依赖于对不同规模上发生的不同现象的准确表征。规模放大方法的一个常见问题是它经常会改变细胞培养的微环境，从而影响产品质量和工艺特性。从早期毒理学研究到临床和商业化生产，确保工艺放大的成功通常需要成本高昂且依赖于大量资源投入的工作。规模缩小方法已越来越多地被行业所采用，并且通常被认为是开发、优化和验证工艺不可或缺的工具，以降低生产风险。
一次性技术越来越多地被匹配用于不同几何形状、体积和搅拌方式的反应器选项，包括基于摇摆式和搅拌罐的生物反应器。许多构建到一次性生物反应器中的新型技术的目的是提供一个可提高细胞生产力的环境，同时保持培养性能，以实现最佳细胞生长和/或产物生产。对于在一次性生物反应器中进行的细胞培养工艺规模放大，必须开发可靠且经过验证的规模缩放相关性，以加快和降低规模转换风险以及批量失败的可能性。
多宁生物提供不同规模的一次性生物反应器，其经过特殊工程设计，可确保成功的规模放大，以帮助实现从工艺开发到临床前/临床物料供应以及商业化生产的产品生命周期不同阶段的顺利过渡。同时，多宁生物完善的技术支持团队可提供细胞培养以及规模放大的专业技术支持，以应对该过程中潜在的挑战，确保成功性。
参考文献：
D.M.Marks,Equipment design considerations for large scale cell culture. Cytothecnology,2003,42:21-22.
M.Micheletti,A.Ducci,Engineering Parameters in Single‐Use Bioreactors: Flow, Mixing, Aeration, and Suspension. Single-Use Technology in Biopharmaceutical Manufacture, 2019.
V.Jossen,R.Eibl,D.Eibl,Single-Use Bioreactor – An Overview. Single-Use Technology in Biopharmaceutical Manufacture. 2019.
下周五（5月20日），我们将分享《基于高通量多联罐的快速Scale-Down工艺开发和优化》，可关注本公众号锁定每周五才华多多的【工艺分享】内容。