肿瘤的异质性与进化耐药
肿瘤异质性是指同一种恶性肿瘤在不同患者个体间或者同一患者体内不同部位肿瘤细胞间，从基因型到表型上存在的差异，这种差异发生在不同个体中可表现出不同的遗传背景，比如染色体量与质的差异，不同细胞病例类型、不同临床阶段不同分化程度细胞演进的多样性；发生在同一肿瘤患者体内可表现出不同部位或同一部位肿瘤细胞间的突变基因谱和生物学特性等方面的不一致，体现了恶性肿瘤在演进过程中的高度复杂性和多样性。
肿瘤异质性分为空间异质性、时间异质性、解剖异质性、结构异质性、基因异质性和功能异质性等。
2012年科学家对两个肾癌患者的原发灶、转移灶样本进行基因测序，发现即便是同一个患者的两个样本，其基因突变也是不同的。每一个患者身上的不同样本能发现100个突变。
图1 原发灶、转移灶、同一病灶不同位置基因突变存在很大差异
2015年，日本学者Akito Hata等对145名NSCLC患者在第1、2代EGFR TKI耐药后进行了再次活检，其中30位患者进行了多个部位的再次活检，另外24位患者进行了同一病变部位的再次活检。
30位患者中，有22位患者的再次活检部位分别来自脑转移病灶（20位来自脑脊液，2位来自脑组织）和胸部病灶（7位来自肺部，14位来自胸腔积液，1位来自淋巴结）。其中，有12位患者胸部T790M突变阳性。而在这12位患者中，有10位患者脑转移病灶的T790M突变为阴性；另外有3位患者胸部再次活检T790M为一种空间异质性突变状态。
24位同一病变部位再次活检的患者中，有5位患者在TKI暂停后T790M突变从阳性变成阴性。其中3位患者在进一步使用TKI后T790M阴性又变成了阳性。一位患者在大剂量的厄洛替尼的治疗后其脑转移病灶再次活检结果从T790M阴性变成阳性。
在2017年18届世界肺癌大会（IASLC WCLC 2017）上，美国麻省总院（MGH）的Piotrowska报道了系列活检标本与TKI靶向治疗耐药的时间和空间异质性的分析。回顾性分析了221例EGFR突变的患者在靶向治疗耐药后的355个组织标本，耐药后的第一次活检标本发现有61%的T790M突变，5%的MET扩增，3%的SCLC转化，2%的PIK3CA突变及1%的BRAF突变。
重要的是：83例患者有两次以上的耐药活检标本，其中52%（43/83）患者的两次标本中突变具有异质性，20%的患者T790M在第二次耐药标本中丢失了，而有11%患者的第二次耐药标本则获得了T790M。17例T790M丢失的患者中，3例出现了MET扩增或BRA F V600E突变。
部分患者同时性的多个活检标本中则发现了空间分子分布的异质性，如T790M/C797S、MET扩增等变异在同一患者的不同病灶中分布是不同的，即一个病灶存在，而另一个病灶不存在这些突变。该研究强调了动态检测的重要性，耐药机制的多样性、时空异质性和单个活检材料的局限性使得对于耐药机制的判断可能会带来偏差。
美国科罗拉多大学和日本大阪Kindai大学的联合研究报道，未经治疗的患者中的肺癌遗传进化与空间异质性的关系。通过收集未经治疗的4例NSCLC、1例SCLC患者尸检的肿瘤标本和非癌组织，采用RNA测序方法分析突变的进化和空间分布，每个患者具有5-9个原发或转移的病灶。
结果发现癌病灶与非癌组织、原发灶与转移灶均能被聚类分析明确区分于不同的集合中，信号通路分析还发现了细胞周期、DNA复制、DNA聚合酶、免疫相关信号通路与转移灶相关。
这个研究提示在未经治疗的患者中，转移灶与原发灶存在分子突变和信号通路方面即存在相似性，又存在异质性，为突变分子的空间异质性的形成提供了初步资料。
上述两个研究为肺癌在自然进展或治疗条件下进展过程中的分子异质性规律提供了初步数据。特别是在EGFR突变的患者中，耐药病灶中存在耐药机制的复杂多样性，同时会发生时间轴上动态变化，如重要耐药机制T790M，C797S，MET扩增等在不同时间点的活检标本既可能消失，又可能再次出现，为临床克服耐药精准方案的选择提出了更大挑战。
很显然，临床需要以时间上动态、空间上多点的眼光看待肿瘤的耐药与进化，结合基因检测技术的应用，才能准确把握克服耐药的决策。
01
应用实例
一位55岁高加索男性患者于2011年10月被确诊为IV期肺腺癌，通过Sanger测序法检测出EGFR L858R突变。在接受了包括厄洛替尼、顺铂/培美曲塞，阿法替尼/西妥昔单抗的多线治疗后，患者在2013年7月出现疾病进展。
对患者左肺上叶原发灶重复活检进行二代测序的基因分析发现L858R突变和2个不同的TP53突变，但未发现EGFR-TKI耐药突变，换用多西他赛/吉西他滨的治疗方案后，在2013年9月发现病情大规模进展（肺、肝、心肌以及左臂软组织）。
在左臂的转移灶中重复活检发现L858R突变，C277突变及高表达的MET扩增，但未发现T790M突变。改用厄洛替尼联用克唑替尼方案治疗一周后，患者左臂、肝、心肌出现明显的反应疗效，随之伴随患者的PS评分提高。然而，在患者原发灶并没有体现药物疗效。
在2013年12月，患者表现出越来越多的呼吸困难。尽管在肝部和软组织转移灶中肿瘤得到控制，但在心肌转移灶发生了疾病进展，联合治疗仍在持续。
2014年1月，患者产生呼吸困难以及左胸腔积液，取胸水进行分子检测发现L858R突变、R110C突变，低水平MET扩增及T790M突变，在外周血标本中也检测到相似结果。之后克唑替尼被停用，患者在2014年2月开始入组奥希替尼临床试验。
2周后评估显示，患者原发灶肿瘤得到控制，但肝部和心肌肿瘤进展明显。由于入组实验不允许联用其他抗肿瘤药，患者退出入组并重启克唑替尼治疗方案。
三周之后，观察到和之前几乎一样的转移灶代谢反应，推测转移灶由高表达得MET扩增基因驱动。然而，由于遭受多次复发的胸腔积液，患者状态恶化，于2014年4月去世。
表1 患者前后6次基因检测结果
该例子展示了一个患者在不同肿瘤部位存在2个不同的EGFR-TKI获得性耐药机制（T790M和MET扩增）的情况，尽管重复活检指导可以暂时控制肿瘤，但由于肿瘤的克隆异质性导致肿瘤不能被持续控制，最终导致疾病严重进展。
这些临床观察不仅仅提供了一个早期联合治疗获得性耐药的理论依据，也指出我们当下对于检测到驱动突变指导治疗方案的认知局限性，并强调目前的分析证明了肺癌患者基因的变化性。
肺癌是分子异质性高度复杂的疾病。对肺癌的分子时空异质性分布的分析越精细，对于肺癌精准方案的应用就会更精准，对于疗效的判断也会提供更多分子机制的解释，对于耐药策略的制定提供更好的科学依据。
用进化的思维去应对肿瘤的耐药，利用这个思想巧妙地与肿瘤进行周旋，结合基因检测技术的应用，达到长期获益，是目前应对肿瘤异质性及进化耐药的一个重要思路。
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参考文献
1.Willyard C，Nature. 2016 Apr 14;532(7598):166-8.
2.M Scheffler, S Merkelbach-Bruse, M Bos, et al. J Thorac Oncol. 2015, 10(6): 40-3.
3.Akito Hata ,Nobuyuki Katakami, Hiroshige Oncology 2015.
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