IF=36.13|早期结直肠癌怎么预防？肠道菌群是关键，宏基因组+代谢组帮你忙

文章题目

Metagenomic and metabolomic analyses reveal distinct stage-specific phenotypes of the gut microbiota in colorectal cancer

发表期刊

Nature Medicine

（IF=36.13）

研究背景

    全世界每年有超过25万人患结直肠癌（CRC），大多数散发的结直肠癌是通过息肉样腺瘤的形成发展而来的，然后发展为黏膜内癌，最终进展为恶性肿瘤。这个过程被称为腺瘤-癌序列，它通过一个涉及特定突变的多步骤机制发生的。因为要经过几十年的时间才能发展成最终的恶性肿瘤。早期癌症及其内镜切除是控制癌症的重点手段。肠道生态系统的改变已涉及人类健康和疾病的变化，包括结直肠癌。粪便宏基因组学可用于定量肠道微生物组，并具有潜在的诊断潜力，肠道代谢物包括氨基酸和细菌代谢物(例如胆汁酸和短链脂肪酸)也与肠道癌变有关。因此，本研究对不同阶段结直肠肿瘤患者的粪便样本进行了宏基因组学和毛细管电泳飞行时间质谱(CE-TOFMS)的代谢组学研究，以获得粪便微生物和代谢物在不同结直肠癌阶段特异性表型。

研究方法

    本研究收集五组样本分别为健康对照组(正常组和息肉组) (n = 251)、多发性息肉样腺瘤组MP (n = 67)、黏膜内癌组S0 (n = 73)、CRC第1和2阶段SI/II (n = 111)、CRC第3和4阶段SIII/IV(n = 74) 、 结直肠手术史组HS (n = 40)。收集五组的粪便样本进行宏基因组测序，测序平台是Illumina HiSeq2500 platform，150bp双端测序。

    本研究收集五组样本分别为健康对照组(n = 149)、MP (n = 45)、S0 (n = 30)、SI/II (n = 80)、SIII/IV(n = 68) 、 HS (n = 34) groups。收集五组的粪便样本进行代谢组学检测，测序平台是毛细管电泳飞行时间质谱(CE-TOFMS)。

研究结果

1. 粪便样本的宏基因组学和代谢组学特征

    宏基因组结果显示富含Bacteroides的受试者Prevotella的丰度较低（图1），在616名患者中，118名患者(19.2%) (在10个最丰富的属中)检测到Megamonas高度丰富，但在其余患者中很少检测到。表明了其分布的差异性。    之前的报道显示在欧洲人和美国人的肠道微生物组研究中，Megamonas不是一个优势菌，但对中国人的研究发现，这种菌是亚洲人的特征菌。宏基因组测序检测到的人类基因组在不同阶段的结直肠癌（CRC）组显著高于健康对照组（图2）。

    主成分分析(PCA)结果显示所有受试者和251名健康对照组比较中确定了两个显著变化的菌群：Bacteroides 、Prevotella，这两种菌都被定义为影响人类肠道类型的主要因素（图3）。616个个体分为4种肠型，用Dirichlet多项混合模型拟合得到以普氏属(Prevotella)为主(图4)。而体重指数、饮酒史和吸烟史在四种肠型中无显著差异。而Prevotella以男性居多（79.1%）。

图1 粪便样本的宏基因组的不同组别的top30菌的相对丰度

图2 粪便宏基因组中的人类基因组含量

图3 菌属的PCA分析

图4 四组中top30菌属的组成

    丙酸盐和丁酸盐是大肠的主要能量来源，是两种最丰富的代谢产物。代谢组学主成分分析结果显示，除了丙酸盐和丁酸盐外，二氢尿嘧啶和尿素的含量也存在较大差异(图5)。PCA分析结果显示，肿瘤各阶段、肿瘤部位或性别与代谢物变化的相关性不大（图6）。

图5 代谢物的PCA分析

图6 按肿瘤位置(c)和性别分组（d）的代谢谱PCA图

2. 不同癌症阶段特异性的分类和代谢组学特征

    与健康对照相比，我们发现在MP和S0阶段的菌群发生显著改变，SI/II和SIII/IV阶段的菌群也发生了显著变化，不同的阶段的差异也是不同的。厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门的丰度在S0、SI/II和SIII/IV标本中显著升高，且随着恶性程度的增加而增加。高丰度的梭杆菌门至少出现在两个阶段，而厚壁菌门和拟杆菌门的许多物种是阶段特异性的。在变形菌门中，大量物种仅在MP阶段丰度表达升高(图7a)。双歧杆菌主要在S0阶段降低。随着CRC的进展，本研究发现有两种物种显著升高的模式：第一种物种在早期到晚期均升高，而第二种物种仅在早期升高。第一种模式的菌包括F. nucleatum、Solobacterium moorei、Peptostreptococcus stomatis、Peptostreptococcus anaerobius、Lactobacillus、Sanfranciscensis、Parvimonas micra和Gemella morbillorum。第二种模式的菌包括Atopobium parvulum、Actinomyces odontolyticus、Desulfovibrio longreachensis和Phascolarctobacterium succinatutens（图7b）。    鉴定了与CRC相关的菌种，其中Colinsella aerofaciens、Dorea longicatena、Porphyromonas uenonis、Selenomonas sputigena和Streptococcus anginosus在SIII/IV显著升高。与之前的研究一致, Lachnospira multipara 和 Eubacterium eligens在CRC阶段显著性降低。硫化物生产菌如Desulfovibrio vietnamensis、D. longreachensis和Bilophila wadsworthia显著升高。    moorei和C. aerofaciiens的复制率在在MP和S0中相对丰度升高，总之，研究表明一些物种的微生物改变可能与早期结直肠癌进展有关。与健康对照组相比，共有65种代谢物在至少一个阶段显示出显著差异。胆汁酸、短链脂肪酸、氨基酸和中心碳代谢物质等与肠道菌群关系密切，是关注的重点(图7c)。    代谢组学分析结果显示与健康对照组相比，MP组中脱氧胆酸盐(DCA)浓度显著升高，S0组中甘胆酸盐和牛磺胆酸盐显著升高。此外，支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸)、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸和丝氨酸浓度均有所增加。异戊酸，一种由细菌发酵产生的支链脂肪酸，从S0到SIII/IV逐渐增加（图7c）。    因为DCA在MP组中升高，寻找可能与该代谢物相关的物种发现B. wadsworthia是MP中唯一与DCA显著相关的物种(图7d)，相关系数在其他阶段均为正，但不显著。    鉴于parvulum在MP和S0组中显著增加，据报道在炎症性肠病患者中，parvulum通过与链球菌的高共生关系构成h2s细菌的网络中枢，进而该物种丰度与其他物种的相关性。在属和种水平上，S0组中与Atopobium相关的细菌数量均显著增加(图7e,f)。在S0阶段或后续阶段，parvulum的相对丰度增加，与a . dontolyticus、S. anginosus、S. moorei和G. morbillorum具有较强的相关性。CRC早期Atopobium的增加表明它可能对h2s产生菌群有很强的影响。

图7 不同癌症阶段特异性的分类和代谢组学特征

3. KEGG通路分析CRC相关的微生物基因的变化

    与健康对照组相比，共有1243个KO基因在至少一个阶段显著升高，96个显著降低。粪便中的氨基酸浓度从S0开始发生了显著变化(图7c)，我们检测了微生物基因丰度，探索微生物在氨基酸代谢中的作用(图8a)。在差异通路中，芳香氨基酸代谢和硫化物生成途径与crc相关。参与苯丙氨酸和酪氨酸生物合成的基因显著升高，其中pheC被确定为区分S0病例组与健康对照组的最高评分标记物。在代谢途径中，通过产生有毒苯乙酸来降解苯丙氨酸的基因主要在MP中升高，SIII/IV组的色氨酸生物合成相关基因显著降低。在SIII/IV中产生遗传毒性硫化氢的异化硫酸盐还原酶亚基A (dsrA)显著升高 (图8b)。

图8  KEGG通路分析CRC相关的微生物基因的变化

4. 不同阶段结直肠癌的微生物动力学及其诊断

    大部分S0阶段病变可以通过内窥镜方法治愈，具有很好的治疗机会。为了找到肠道宏基因组学和代谢组学的诊断标志物，本研究构建了随机森林和LASSO逻辑回归分类器来区分S0组和SIII/IV组与健康对照组。仅基于物种、仅基于KO基因、仅基于代谢物或三者结合构建了4种模型。比较四种模型的分类潜力，最终发现组合模型在S0和SIII/IV分类都优于单个模型(图9b,c)。应用随机森林分类器区分S0和SIII/IV CRC患者的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.78和0.85。    在S0分类中，主要特征是KO基因，包括pheC。其他特征包括D. longreachensis、S. moorei、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和琥珀酸(图8b)，这些特征显著差异。SIII/IV分类中排名第一的特征包括口腔厌氧菌，如P. micra、P. stomatis、F. nucleatum和P. anaerobius，这些已被鉴定为CRCs的标记物(图8b)。    本文收集了28例结直肠癌（SI/II和SIII/IV）患者术前和术后1年的宏基因组数据。切除肿瘤后，图7b中所示的22个物种中，P. stomatis、P. anaerobius、P. micra、P. uenonis和D. longicatena的在肿瘤切除后阶段相对丰度降低（图9d,e）。这5个物种与HS组的粪便样本进行比较结果发现无显著差异（图9f）。

图9 不同阶段结直肠癌的微生物动力学及其诊断

    研究结果表明，除了较晚期外，MP组和S0组的微生物组和代谢组也发生了变化。不同阶段的变化是非常不同的。在多发性息肉样腺瘤和粘膜内癌的病例中，除了更晚期的病变外，微生物组和代谢组变化也很明显，并发现了两种截然不同的微生物组升高模式。首先，具核梭杆菌属（Fusobacterium nucleatum spp.）的相对丰度在粘膜内癌中至晚期持续显著升高（P< 0.005）。其次，在多发性息肉样腺瘤和/或粘膜内癌中，极小阿托波氏菌（Atopobium parvulum）和龋齿放线菌（Actinomyces odontolyticus）显著增加（P< 0.005）。代谢组学分析显示，粘膜内癌支链氨基酸和苯丙氨酸显著升高（P< 0.005），而包括脱氧胆酸在内的胆汁酸在多发性息肉样腺瘤和/或粘膜内癌中显著升高（P< 0.005）。最后确定了用于区分粘膜内癌和健康对照组的宏基因组和代谢组学标记物。

结论

    总之，本文发现在结直肠癌进展过程中肠道微生物组成、肠道菌群基因丰度和代谢产物的动态变化。虽然目前还不清楚这些物种和代谢物是否直接导致肿瘤发生，但肠道微生物群结构的改变可能导致致癌微环境的改变。此外，本研究强调CRC的进展可能受到整个微生物群的代谢输出以及癌症相关生物体的存在的影响。结果表明CRC从根本上来说不仅是一种遗传疾病，也是一种微生物疾病。本研究结果表明，肠道微生物组的变化存在于结直肠癌发展的早期阶段，这可能为该疾病提供重要的诊断和致病线索。

参考文献

Metagenomic and metabolomic analyses reveal distinct stage-specific phenotypes of the gut microbiota in colorectal cancer. Nature Medicine. 2019 Sep; 25(6): 968-976.

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