【项目文章】一种新的PROTAC药物研究策略

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文章题目

A nano-predator of pathological MDMX construct by

clearable supramolecular gold(I)-thiol-peptide

complexes achieves safe and potent anti-tumor activity

文章信息

合作单位：西安交通大学第一附属医院

发表期刊：Theranostics

影响因子：11.58

发表时间：2021.2

前言

    近年来，具有高度选择性和效能的蛋白质降解技术在药学中的潜在应用逐步受到关注。其中，起到诱导靶蛋白降解作用的蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimeras，PROTAC）是近年来药物研发领域的新热点之一。目前，PROTAC 的研究主要围绕理性合理设计PROTAC 分子、发现新型E3 泛素连接酶配体和提升PROCTAC 分子成药性等方面，相关理论发展迅速。

    西安交通大学第一附属医院设计了一种新型PROTAC药物研究策略-Nano-MP@PSI。其中肽基分子胶（MG）是一种广泛的双功能配体，通过模仿蛋白质相互作用（PPI），同时与靶标蛋白和E3连接酶结合。在此，研究者设计了一种肽衍生MG，以肿瘤驱动蛋白MDMX为靶点进行降解，并将其纳米化成超分子金（I）-硫醇-肽复合物（Nano-MP），来实现蛋白质水解抵抗、细胞内化和谷胱甘肽触发释放。为了优化Nano-MP的肿瘤靶向性，研究者合成了一种pH响应性大分子聚丙烯酸磺基咪唑（PSI）来包覆纳米Nano-MP。同时为了标识该纳米材料在体内的蓄积和清除效果，对嵌合体中Au进行检测。嵌合体中Au的检测，由诺米代谢提供。

    与预期的一样，Nano-MP@PSI通过泛素化的方式诱导MDMX降解，随后恢复p53和p73的抗癌功能。Nano-MP@PSI在眼内注射的视网膜母细胞瘤原位异种移植小鼠模型和全身注射的恶性胰腺癌患者源性异种移植小鼠模型中显示了强大的抗癌活性，同时能保持一个良好的非靶向细胞的生物安全性和从活体中快速清除。

    总的来说，这项工作不仅为多种给药类型治疗多种肿瘤提供了临床可行的范例，更重要的是，它弥合了肽和PROTACs之间的鸿沟，而且很有可能重新推动针对多种疾病的肽源蛋白水解靶向嵌合体的发展。

图1

研究背景

      当今世界范围内，药物监管机构针对大约400种人类蛋白质批准了治疗药物，大部分都是一些酶、转运体和受体。在人类蛋白质组鉴定中的治疗靶点，属于非酶蛋白、转录因子和骨架蛋白类别的3000种致病蛋白中，85%以上是“不可药的”，这主要是由于这些蛋白质不能被用于开发小分子化合物来抑制其生物功能。即使在13%的可药物靶标中（3000种中有400种），其常规治疗策略也更倾向于利用高剂量的药物暴露来占领活性部位，但这增加了非靶点细胞的毒性。

研究结果

1. Nano-MP和Nano-MP@PSI的设计、合成及表征

      MP由三部分组成：1）MDMX binding motif；2）一种柔性三聚乙二醇（PEG）；3）连接子，含有羟脯氨酸和高脂亮氨酸的八肽，由VHL识别，它是Cul2-Rbx1-EloB/C-VHL E3泛素连接酶复合物的一个目标招募亚基（图2A）。在MP的C端引入了Cys和Arg残基，用于纳米团簇的构建。经过FMOC化学合成，MP易于固相肽合成，收率为75%，纯度为＞95%。在温和的条件下，实现MP的纳米工程的步骤：

      步骤一：1㎎MP和1㎎NH2-PEGn-SH(MW 2000 Da)加入5mL 20 mM HAuCl溶液中搅拌5min。

      步骤二：加入5mL100mM的HEPES（pH7.4），溶液颜色变为紫色。

      为了制备肿瘤微环境（TME）响应型纳米团簇，合成聚酰基咪唑(PSI)，用于包裹Nano-MP。在PSI合成中，巯基咪唑首先与N-琥珀酰-6-马来酰亚胺己酸酯反应，制得N-琥珀酰亚胺-3-马来酰亚胺巯基咪唑。其次，该活性咪唑与聚丙烯酰胺(MW 20000 Da)通过PAA的氨基与羧基荧光素二乙酸丁二酸酯反应，与聚丙烯酰胺(MW 20000 Da)偶联。得到的PSI可以在Nano-MP表明涂覆，得到Nano-MP@PSI。

图2

2. PSI修饰进一步增加了血液循环时间和肿瘤特异性蓄积

      纳米药物在血液循环时间和肿瘤特异性蓄积对其抗肿瘤作用至关重要。用ICP-MS对健康C57L/B6小鼠血液中的Au进行检测，发现Nano-MP@PSI相比Nano-MP，在血液循环中时间更长（图3B）。此外，在含有20%血清的PBS缓冲溶液中孵育72h后，颗粒中含有＞90%的肽，证明Nano-MP@PSI在血液循环中的完整性（图3A）。

      同时咪唑的解离常数在6~7之间，因此在TME中，PSI在pHe上会进一步质子化。与预期一样，Nano-MP@PSI的zeta电位在pH7.4时从28 mV移至pH6.0时的50 mV（图3C）。具有强正电荷的纳米粒子能以负电荷静电吸附到癌细胞上，进而触发细胞内化，其在pH6.5时，内化增强。在pH7.4的正常生理环境中，TME中的质子化Nano-MP@PSI增强细胞膜通透性，使得其能够进入细胞内，并在肿瘤细胞中产生蓄积，其中相比Nano-MP，PSI修饰后的Nano-MP@PSI进一步增强了肿瘤特异性蓄积。

图3

3. Nano-MP@PSI可以触发释放货物并从体内排出

      Au（I）-烯醇键会由于癌细胞中谷胱甘肽（GSH）浓度过高而发生断裂，同时在细胞环境中保持稳定。当受到刺激时，Nano-MP可以分解成一个只有~5nm的纳米粒子，以此来响应细胞内的还原环境（图4A）。在拆卸过程中，pH6.0条件下，在含有标准PBS和5mmGSH的模拟胞外环境中孵育3小时，可发现~90%的MG释放（图4C）。表明这种复合材料是一种稳定可行的肽类物质细胞内传递和释放的平台。

      这种纳米粒子，可以有目的的将药物运送到靶细胞，同时还能避免在非靶细胞中蓄积而产生细胞毒性。＜6nm的纳米粒子可以在全身或部分给药后从体内排出，由于其颗粒很小，其还拥有穿透屏障的能力。研究者为了研究其清洁性，用质谱法对对小鼠玻璃体内注释Nano-MP的扰动运动学进行了检测和定量，发现超过70%的Au在8小时候消失，2周后完全消失（图4D）。

图4

4. Nano-MP@PSI诱导MDMX降解及p5 3和p73的修复

      研究者利用免疫印迹法，对空白载体（Nano-PEG@PSI），以及两种控制MDMX降解的物质（ Nano-DPMI@PSI和Nano-MMP@PSI）以及Nano-MP@PSI，研究其对MDMX高表达的p5 3和p73野生型视网膜瘤细胞系的作用，发现Nano-MP@PSI处理后MDMX显著下降，其他组无明显变化。而Nano-DPMI@PSI、Nano-MMP@PSI和Nano-MP@PSI都能稳定p53、p73和p21（图5A）。发现Nano-MP@PSI上调了p53信号通路中的调控蛋白，其作用大于Nano-DPMI@PSI和Nano-MMP@PSI。同时还发现，Nano-MP@PSI是利用泛素依赖的降解途径来诱导MDMX的降解的。

      研究者还通过转录组，从基因层面，发现WERI-Rb-1细胞系在含有Nano-MP@PSI的培养基中孵育24小时后，差异基因显著富集在与p53和p73相关通路上。

图5

5. Nano-MP对原位异种移植小鼠视网膜母细胞瘤的抑制作用

      研究者发现Nano-MP@PSI，在第11天时，能显著治疗异种移植视网膜母细胞瘤小鼠模型的视网膜母细胞瘤的进展，效果比Nano-DPMI@PSI更好。此外，与NS处理的小鼠相比，Nano-MP@PSI-或Nano-DPMI@PSI处理组小鼠的体重(图5A)和脏器病理形态(图5B)均无明显变化，说明纳米颗粒本身没有任何急性毒性。

图6

6. Nano-MP@PSI在胰腺癌的PDX模型中诱导回归

      由于同种异种单细胞肿瘤小鼠模型几十年来一直是肿瘤学研究的标准工具，但是单细胞肿瘤的主要组织学、遗传学和微环境特征与实际肿瘤存在显著差异。为了进一步研究Nano-MP@PSI的治疗效果，研究者将其与Nano-DPMI@PSI对肿瘤生长、肿瘤重量、肿瘤细胞凋亡以及MDMX、p53、p21水平的影响进行了对比研究。结果表明，Nano-MP@PSI通过降解MDMX和随后的p53以及p73，在保持高度良好的生物安全性的同时，增强了KRAS突变型胰腺癌的治疗效果。

结论

      Nano-MP代表了肽化学和纳米技术的成功结合，PROTAC分子生物成功设计，显示了肽衍生纳米降解物在靶向PPIs致病相关蛋白方面的巨大潜力。本文报道的策略将很容易扩展到其他肽-蛋白质相互作用，显著弥合肽和PROTACs之间的鸿沟。总之，这项研究不仅证实了MDMX的降解是一种有前途的抗癌治疗临床策略，而且更重要的是，为肽源PROTACs转化为潜在的候选药物提供了一种可行的方法，并可能为各种疾病的非药物靶点的发现工作重新注入活力。

参考文献

A nano-predator of pathological MDMX construct by clearable supramolecular gold(I)-thiol-peptide complexes achieves safe and potent anti-tumor activity[J]. Theranostics, 2021.

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