【原创】药物设计与变构之激酶篇
从细胞分裂增殖到凋亡，人类基因组编码的518个蛋白激酶参与了多种生理过程的功能调节，其异常激活直接或间接导致多种重大疾病（如肿瘤）的发生发展，因此激酶已成为药物开发的最重要靶标类型之一。尽管不同激酶的氨基酸序列具有一定多样性，但其发挥功能的催化核心三维结构域高度相似，大体由较小的N端结构单元和较大的C端结构单元组成，而激酶底物ATP的结合位点就位于两个结构单元之间的夹缝中。由于其结构的保守性，针对激酶开发选择性抑制剂一直是药物设计与发现中巨大的挑战。变构位点在靶标家族内成员间具有结构多样性和构象可诱导性的特点(参见“药物设计与变构之历史”)，正好可以克服激酶中ATP结合位点抑制剂选择性差的问题。近年来利用激酶变构位点设计抑制剂正成为激酶药物开发中的潜力方向，而激酶变构药物的上市(如2016年的MEK1/2变构抑制剂Trametinib)更是极大的提升了变构药物在未来激酶药物发现中的更多期待。随着高通量筛选和结构生物学的确认，在激酶家族中已发现多个位置的变构位点，我们就结合这些位点给大家介绍一下变构激酶药物的主要研究进展。
Akt1属于Ser/Thr AGC蛋白激酶家族的成员，其催化结构域可被与之相连的PH结构域的通过蛋白-蛋白相互作用调节。在Akt1失活状态时，PH结构域紧密覆盖在催化结构域上面，阻碍ATP结合到Akt1催化位点（这种状态也被称为“PH-in”构象）。在胰岛素刺激下磷酸肌醇3激酶（PI3K）催化产生PIP3，Akt1募集到细胞膜上，PH结构域被其上游蛋白激酶磷酸化而激活，呈现脱离催化结构域的“PH-out”构象，这时ATP和底物可以进入活性位点从而进行酶催化反应。
Akt1的变构位点被发现就位于PH结构域和催化结构域的相互作用界面上，该位点与ATP结合位点相距大于10Å。两个经典抑制剂VIII（28）（PDB代码：3O96）和12j（29 ; PDB代码：4EJN）的Akt1复合物晶体结构清楚地显示变构抑制剂结合到PH结构域和激酶结构域之间的变构位点。从结构上我们可以看出，这些变构抑制剂诱导了Ak1的PH结构域和催化结构域之间产生强相互作用，将Akt1锁定在失活关闭的构象上。这个位点为设计Akt1选择性变构抑制剂治疗癌症相关疾病的提供了“老靶标新用”的机会。
PDK1
PDK1也属于Ser / Thr AGC蛋白激酶家族。PDK1的催化结构域在N端结构单元上存在一个疏水口袋，称为PIF位点。PIF位点可以被PDK1催化的下游底物蛋白中C端疏水性motif（HMs）结合。一旦PIF位点被占据，PDK1催化活化便急剧增加。Hindie等人筛选了一系列针对PIF结合口袋的化合物，其中代表性的就是变构激活剂PS48（30），其AC50值为8μM。PKD1-PS48复合物的晶体结构（PDB代码：3HRF）显示PS48紧密结合在PDK1的PIF位点，引起PIF结合位点中的残基构象局部微调，并进而诱导ATP结合位点和活化环中构象显著发生改变，稳定了PDK1的激活构象。未来PIF位点可以考虑设计占据部分位点而不产生效应的化合物，从而阻断PDK1来自下游底物蛋白的反馈激活。
Abl属于Tyr蛋白激酶（TK）家族，主要调控细胞增殖，分化及凋亡等信号通路。Abl在催化结构域前有两个Src同源结构域（SH3和SH2），这两个SH结构域对Abl催化活性的自身抑制起关键作用。当Abl形成破坏其自抑制构象的BCR融合蛋白时，引发Abl的异常高活性，从而导致CML等疾病。Abl作为CML的药物靶点，已经上市多个药物，包括伊马替尼（STI-571 /Gleevec），尼罗替尼（AMN-107/Tasiga）和达沙替尼（Sprycel）等，主要作用于ATP结合位点。然而，“gatekeeper”的T334I突变会使这些抑制剂无效出现耐药，并引起临床晚期阶段CML患者复发。Abl变构位点的发现为这一耐药现象提供了新的解决方案，位于Abl催化结构域的C端myristate结合位点被认为是一个可以有效抑制Abl活性的位点（PDB代码：3K5V），以GNF-2（31）为代表的抑制剂结合到这个变构位点使得SH3和SH2结构域交联到催化结构域，从而将Abl转化为“封闭”的失活状态。因此，这一变构位点的抑制剂可以特异性抑制BCR-Abl转化细胞系的增殖，显著克服T334I相关的耐药抗性。
CDK2
Ser / Thr特异性细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）是细胞周期过程的关键调节因子，CDK2调节异常可导致多种疾病，如癌症和炎症等。CDK2的活性取决于其与cyclin蛋白的关系。尽管已经报道了许多ATP竞争性抑制剂，但由于缺乏靶点选择性，并没有从临床试验中鉴定出可行的候选药物。最近，Betzi等发现CDK2和cyclin蛋白的界面上存在有一个潜在的变构位点，该位点存在于CDK2结构中αC螺旋上方的天冬氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（DFG）区域延伸的大口袋中，并远离ATP结合位点。8-苯胺基-1-萘磺酸盐（32，ANS）作为新型CDK2抑制剂通过双分子结合在这个位点后，可以引起CDK2产生较大的构象改变，αC螺旋显著的向外运动导致CDK2与cyclin不再结合，从而抑制了CDK2的活性。
CK2
酪蛋白激酶2（CK2）属于Ser / Thr CMGC蛋白激酶家族，主要参与细胞凋亡抑制，细胞存活和肿瘤发生。Raaf等最近发现在CK2α的N端β折叠外表面和连接β4和β5折叠环组成的区域存在一个变构位点（PDB码：3H30），抑制剂DRB（33）可以同时结合在ATP结合位点和这个变构位点上，DRB与变构位点的结合导致了N端β折叠和β4/β5环的构象改变，发挥抑制CK2作用。因此，DRB可以作为一种变构先导化合物用于开发针对CK2的变构药物。
有丝分裂原激活蛋白（MAP）激酶1（MEK1）是一种双重特异性Tyr /Thr蛋白激酶，是抗增殖性疾病干预的潜在靶点。Ohren等人发现ATP结合位点相邻的疏水性裂隙可以形成一个新的变构位点（PDB代码：1S9J）。PD184352（34）结合在这个变构位点中诱导MEK1催化结构域包括αC螺旋的N端构象改变，将MEK1锁定在失活构象状态，从而抑制其催化活性。
其他蛋白激酶
除了上述6个讨论的案例之外，还有至少81个其他蛋白激酶在变构数据中心(http://mdl.shsmu.edu.cn/ASD)中观察到有通过生化方法确认的变构调节剂，但其变构位点尚未解析，如表皮生长因子受体，胰岛素样生长因子1受体，血管内皮生长因子受体， AMP活化的蛋白激酶， 6-磷酸果糖激酶，葡萄糖激酶，腺苷激酶， MAP激酶，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Chk1，蛋白激酶C， cAMP依赖性蛋白激酶等，说明变构位点在激酶中作为药物设计的靶点具有远超我们已知的适应性和广阔前景。
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