【First-in-class药设系列】靶向调节磷酸酶PPP1R15B的抑制剂发现
在面对新靶标发展First-in-class药物先导时，首要问题就是是否能设计一个合理可靠、精度灵敏度俱佳的靶标筛选体系。当前，随着对生命体系理解的不断深入，越来越多全新机制的靶标展现在我们面前，传统kinase底物水解、GPCR同位素/钙流及Protein-protein interaction的荧光多肽等筛选方法已远远不能反映出新型靶标的作用机制。基于机制建立反映新型靶标功能的筛选体系是药学基础领域的重要创新，也为未来药物候选临床II期疗效证明阶段降低了错靶无效的风险。近日，英国剑桥大学的研究团队在Cell上发表了靶向调节磷酸酶PPP1R15B的首个选择性抑制剂，用于Huntington疾病的治疗。在这个工作中，他们设计的SPR自组装筛选体系为抑制剂苗头化合物的发现起到了关键的作用。
真核细胞翻译起始因子eIF2α(α subunit of eukaryotic translation initiation factor 2)通过其磷酸化(第51位丝氨酸)调控细胞内的蛋白合成速率。eIF2α的磷酸化主要由其上游异源磷酸酶复合物PPP1R15A(R15A)/PP1c和PPP1R15B(R15B)/PP1c来完成。生理状态下R15B/PP1c来完成对eIF2α的去磷酸化调控，而应激状态下R15A/PP1c发挥作用。在这两种异源复合物中，R15B和R15A是不同的调节亚基，PP1c都是催化亚基。前期研究发现，如果异源磷酸酶复合物R15B/PP1c能被抑制，eIF2α的磷酸化状态得以维持，使得新蛋白合成量减少，可以使细胞内蛋白降解体系负荷减轻，有能力更多处理已存在的错误折叠蛋白(misfolded protein)，从而减轻由于错误折叠蛋白引起的疾病，如Huntington疾病。
研究根据R15B/PP1c先形成异源二聚体，再发生对eIF2α去磷酸化发生反应这一机制，建立了自组装SPR表面等离子共振的筛选方法。这一方法主要分为三步：第一步是将生物素化的PP1c偶联至固定相的SPR-SA芯片上；第二步用R15B流动相流过芯片，使其自组装到PP1c上，完成重组全酶筛选体系的构建；第三步在全酶体系下来改变流动相为小分子库，筛选可以结合到这一异源二聚体的小分子。
利用该筛选体系发现苗头化合物，并通过药物化学方法优化合成了69个化合物，再利用这一方法加以验证。其中化合物Raphin1亲和力可高达0.033±0.02μM，并在R15B和R15A之间有30倍的选择性。
随后进行了细胞实验证实，Raphin1加药后eIF2α的磷酸化迅速上升并减缓了蛋白质合成，并与蛋白质翻译有关的ATF4和R15A表达变化时间一致，证明了Raphin1在细胞中的特异性。
研究者通过体外建立R15B的不同截断体，证明Raphin1可以选择性抑制R15B的位点在其N端，并与底物的结合有关系。Raphin1是通过影响R15B与其底物的亲和力变化，降低了R15B对eIF2α的招募，而不影响R15A。因此，Raphin1选择性地结合R15B，导致其招募底物功能的改变，从而减低去磷酸化作用。
新靶标识别的另一个重要环节是要明确其作为靶标作用下游的机制。研究表明，Raphin1结合R15B会诱导产生构象异常，这一构象异常化的蛋白会被质量控制系统识别并递送到AAA ATP酶p97靶向降解。
新靶标识别及其抑制剂功能的基础研究还是需要在动物模型体内进行确认，正如药物应用开发需在临床II期人群中疗效获得验证一样。该研究发现Raphin1非常适用于 HD82Q的突变型亨廷顿转基因小鼠的治疗。在口服Raphin1 2mg/kg 一天一次的剂量时，可以使年龄4~10周的小鼠恢复正常体重，并显著降低了SDS不溶的亨廷顿蛋白和皮质中的核内含物。如细胞实验一样，在野生型小鼠的大脑中，Raphin1可以瞬时引起细胞蛋白合成减缓。同时，Raphin1并没有显著毒性，对小鼠的体重、肝、胰岛功能和记忆等各种实验没有可检测到的不利影响。
综上，该研究基于靶向eIF2α的磷酸酶调节亚基R15B，首次识别了选择性抑制剂Raphin1。这一先导化合物结合到R15B的N端，通过诱导构象变化，影响底物招募和eIF2α去磷酸化；构象变化后的R15B通过p97依赖性的蛋白酶体途径降解。Raphin1不仅在突变型亨廷顿转基因小鼠模型中体现了eIF2α的磷酸酶调节亚基R15B的靶标潜力，也为该靶标未来药物研发的提供了优质的先导化合物基础。
参考文献
[1] Krzyzosiak, Agnieszka, et al. "Target-Based Discovery of an Inhibitor of the Regulatory Phosphatase PPP1R15B." Cell 174.5 (2018): 1216-1228.
[2] Carrara, Marta, Anna Sigurdardottir, and Anne Bertolotti. "Decoding the selectivity of eIF2α holophosphatases and PPP1R15A inhibitors." Nature structural & molecular biology 24.9 (2017): 708.
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