【First-in-class药设系列】活性位点突变方法设计AAA蛋白Spastin的抑制剂
人体内AAA超家族（与多种细胞活性相关的ATP酶）含有约100种蛋白，广泛参与多种细胞过程，包括细胞分裂、细胞骨架形成及细胞器的生物发生等。其中，Spastin是细胞分裂和胞内囊泡转运所必需的微管切割AAA蛋白（与多种细胞活性相关的ATP酶）。然而，对人类Spastin蛋白进行动态调控的小分子抑制剂仍是空白。近日，美国洛克菲勒大学Tarun M. Kapoor课题组在Nature Chemical Biology上发表了一篇题为“Designing a chemical inhibitor for the AAA protein spastin using active site mutations”的文章，通过”resistance-conferring mutations”的活性位点突变方法设计了人类Spastin的首个ATP竞争性抑制剂Spastazoline，从而初步揭示了人类AAA超家族的Spastin蛋白在细胞分裂动态过程中的功能。
“resistance-conferring mutations”是指一类对于蛋白的酶活没有影响，但是会阻断小分子结合的突变，可适用于表型筛选小分子并判断其是否结合于目标蛋白而非脱靶(在小分子野生型体系中有效而在突变体体系上无效)。为了获得Spastin的小分子，研究人员开始寻找Spastin上的这类突变。由于缺乏人类Spastin蛋白结构，他们首先基于现有的果蝇Spastin（Dm-spastin）结构数据，比较了Dm-spastin与Hs-FIGL1（人类）、Hs-PCH2（人类）、Mm-VCP（鼠）、Xl-katanin（爪蟾）等相关AAA蛋白的AAA结构域序列，发现在Dm-Spastin底物位点内ATP腺嘌呤6 Å内范围内的大多数残基在上述AAA蛋白中非常保守，仅4个位置的氨基酸残基显著不同，提示这4个位置残基是AAA蛋白底物位点的可变化残基。通过在上述4个位点上残基突变筛选，发现Dm-spastin的Q488V/N527T/T692A的突变体Kcat和K1/2与野生型相比活性变化不大，可作为resistance-conferring mutations。
基于Dm-spastin的结构分析，研究人员挑选了33个化学结构迥异的杂环骨架激酶抑制剂作为起始，发现Compound 4对Dm-spastin的活性和选择性较高。进而利用resistance-conferring mutations发现Compound 4明显降低对Dm-spastin的活性，说明Compound 4是直接与这些突变残基发生相互作用。这些数据表明Compound 4的吡唑并喹唑啉骨架可作为Spastin的ATP竞争性抑制剂开发的起点。
为了研究Compound 4与Dm-spastin的结合模式，研究人员利用Dm-spastin结构和resistance-conferring mutations的位置，对Compound 4在核苷酸结合位点进行分子对接，并根据对接模型对Compound 4进行结构修饰获得了活性提升约10倍的Compound 5。
根据人类Spastin蛋白（Hs-spastin）和Dm-spastin在序列上的差异及Compound 5在Dm-spastin的对接模型，研究人员发现Hs-spastin的N386与Compound 5的喹唑啉环可能具有相互作用，继而利用吡咯并嘧啶替换Compound 5的喹唑啉母核，得到Compound 6，其活性较Compound 5提高约30倍。由于该系列化合物的先导化合物是从激酶抑制剂中得来的，可能存在脱靶效应。为了降低脱靶活性，研究人员将Compound 6哌嗪基上2-甲基改成3-异丙基，得到Compound 7（Spastazoline），以便增加与激酶口袋相互作用的空间位阻，但不破坏与Hs-spastin结合。经过上述优化，Spastazoline对Hs-spastin的IC50为99±18 nM，对其他激酶无明显的抑制效果，且对其他四种相关AAA蛋白无明显抑制。通过resistance-conferring mutations N386C的验证，发现Spastazoline抑制活性较野生型降低了100倍以上，再次证明了Spastazoline对Hs-spastin的直接作用。
在获得Spastazoline后，研究人员利用其研究了Hs-spastin在细胞分裂过程中的功能及其依赖性的表型。发现Spastazoline可通过干扰Hs-spastin活性抑制细胞间桥分解，Hs-spastin的活性和局部动力学影响了有丝分裂后期核膜的再形成。
综上所述，研究人员通过活性位点突变方法设计了Hs-spastin的ATP竞争性抑制剂spastazoline，并利用抑制剂spastazoline检测了Hs-spastin在动态细胞过程中的功能。这种基于活性位点突变开发的策略有助于那些缺乏体外高通量筛选体系的靶标进行抑制剂的开发。
参考文献：
1.Lumb, J.H., et al., The AAA ATPase spastin links microtubule severing to membrane modelling. Biochim Biophys Acta, 2012. 1823(1): 192-7.
2.Cupido, T., et al., Designing a chemical inhibitor for the AAA protein spastin using active site mutations. Nat Chem Biol, 2019. 15(5): 444-452.
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