【First-in-class药设系列】诱导铁死亡的抗肿瘤小分子发现及其靶标识别
铁死亡（Ferroptosis）作为一种非凋亡的新型细胞死亡方式，主要细胞内产生了致死水平的脂质活性氧自由基（lipid Reactive Oxygen Species,lipid ROS）积累，而这一积累过程需要铁离子的参与，因而称为铁死亡。利用铁死亡进程进行抗肿瘤药物开发处于起步阶段，近日Nature Chemistry发表了合成改造于天然产物的活性小分子ferroptocide，具有快速稳健地诱导肿瘤细胞死亡的效应，并进一步通过机制研究发现其作用的新靶标硫氧还蛋白(Thioredoxin, TXN)。这一发现为利用铁死亡进行抗肿瘤新靶标新机制的药物研发开创了重要的前期基础和优质先导分子。
天然产物一直以来都为药物研发提供多种立体结构多样的小分子骨架，包括达菲在内的多种上市药物均来自于对天然产物骨架的改造。二萜天然产物pleuromutilin是真菌的有效抑制剂，由多环组成，并有8个连续的立体中心。研究人员使用“复杂到多样”策略(complexity-to-diversity，CtD)对其进行化学多样性改造，合成了17个具有不同修饰的化合物，在抗肿瘤表型初筛中发现其对卵巢透明细胞癌ES-2细胞具有杀伤活性，进一步优化获得了ferroptocide分子，该化合物已经不再具有抗真菌活性，而是特异性对ES-2细胞比化疗药5-FU具有更好的效果。
为了进一步阐明这类新骨架分子的抗肿瘤机制，研究人员将ferroptocide的细胞死亡速度与其他批准的具有明确机制的化学治疗药物进行比较，发现在不同癌症类型的多种细胞系中，由ferroptocide诱导的细胞死亡很快，由此猜测其诱导非凋亡细胞死亡。通过AV / PI染色分析，透射电子显微镜（TEM）检查由ferroptocide诱导的细胞形态变化等数据，再次表明ferroptocide快速诱导的非凋亡细胞死亡与线粒体密切相关，对线粒体活性具有破坏性作用。
进一步机制筛查发现，利用亲脂抗氧化剂trolox，抑制剂ferrostain、铁螯合剂DFO等处理ES-2细胞，它们显著保护了ferroptocide诱导的细胞死亡，而对细胞凋亡诱导剂Raptinal没有作用，提示ferroptocide处理后的铁依赖性脂质过氧化积累是细胞死亡的原因。
SAR表明ferroptocide生物活性取决于亲电基团α-氯酯的存在，提示其可能对靶标进行了共价修饰。接下来研究人员进行凝胶内荧光研究评估细胞中的共价修饰。将来自HCT 116细胞系的高亲和力靶标与ES-2细胞中鉴定的靶标进行比较。为了区分细胞外和细胞毒性相关的靶标，他们还使用siRNA和CRISPR-Cas9策略。排除了PTGES2，PGLS，TXNRD1，TXNRD2，TXNRD3和PDP1蛋白，最终确定其靶标是硫氧还蛋白（thioredoxin,TXN)。
硫氧还蛋白是一种12kDa普遍存在的氧化还原酶，在硫氧还蛋白抗氧化系统中起关键作用。为了鉴定ferroptocide修饰硫氧还蛋白的位点，他们分别突变了TXN的5个半胱氨酸为丝氨酸，荧光标记实验结果表明修饰的活性位点在TXN的C32S、C35S和C73S这三个位置。ferroptocide可以共价修饰改变TXN的上述半胱氨酸，从而抑制其在细胞中的活性。由于硫氧还蛋白是主要抗氧化系统的关键组成部分，该调节可能使细胞易受氧化应激的影响，从而导致脂质过氧化和细胞过程中的其他不平衡，最终导致细胞死亡。在小鼠模型中进一步验证了Ferroptocide对小鼠皮下4T1肿瘤生长的抑制。
因此，利用天然产物丰富的骨架进行筛选会提高新机制的药物发现。然而要将其用于研发药物，并解决天然产物普遍存在的体内靶标混杂性问题，不仅要解决其合成的可行性以便于优化，更为重要的是，在疾病中对于天然产物来源小分子的机制研究，并明确其主要靶标，也是其成为潜力药物活性分子进行药物研发的必要因素。
参考文献：
Llabani E, Hicklin R W, Lee H Y, et al. Diverse compounds from pleuromutilin lead to a thioredoxin inhibitor and inducer of ferroptosis[J]. Nature chemistry, 2019: 1.
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41557-019-0261-6