组蛋白翻译后修饰是表观遗传调控的重要部分，主要包括乙酰化、磷酸化和甲基化修饰等。这些修饰可被多结构域组蛋白修饰酶的reader结构域识别。表观遗传reader结构域结构多样，可分为溴结构域、PHD结构域、甲基赖氨酸和/或甲基精氨酸结合结构域。靶向特定结构域的选择性化学探针，成为研究表观遗传调节因子生物学功能的有力工具，同时也为药理学研究提供概念验证，进而转化为抗肿瘤药物。
NSD3是NSD（Nuclear Receptor Binding SET Domain）家族蛋白赖氨酸甲基转移酶的一种，由位于8p11-p12扩增子的WHSC1L1基因编码，常在乳腺癌和肺鳞癌中表达增多。NSD3是一种多结构域蛋白，存在long、short和睾丸特异性Whistle三种亚型。NSD3-long和Whistle亚型均含有SET结构域，具有赖氨酸甲基转移酶活性，以及多个染色质reader结构域，包括PHD和PWWP结构域。NSD3-short亚型仅含有第一个PWWP结构域。近期研究表明NSD3-short作为一种接头蛋白，将BRD4偶联到染色质重塑CHD8上。该功能依赖于PWWP1结构域。NSD3的PWWP1是急性髓系白血病（AML）细胞存活所必需的。但至今仍没有靶向PWWP1结构域的化学探针。近日，来自勃林格殷格翰公司的药物研发人员在Nature ChemicalBiology上报道了基于片段筛选发现具有细胞活性的选择性NSD3甲基转移酶PWWP1结构域（NSD3-PWWP1）拮抗剂BI-9321。
研究人员首先针对NSD3的截短体（残基247-398）利用饱和转移差谱NMR（STD-NMR）和差示扫描荧光法（DSF）筛选了1899个化合物的专有片段库，得到302个hit。为了区分多个潜在的结合位点，研究人员通过加入二甲基组蛋白H3K36肽（H-STGGV-Lys(me2)-KPHRY-OH）后特定的化学位移扰动模式标出了甲基赖氨酸结合位点，最终从302个hit中得到15个交叉峰化学位移扰动与二甲基组蛋白H3K36肽相似的hit。研究人员利用二维15N TROSYNMR滴定试验测定了15个hit的Kd，并对Kd小于2 mM的化合物进行共晶和浸泡（soaking）试验。只有结合模式经过蛋白晶体确认的化合物才进行后续研究。研究人员利用硒代半胱氨酸标记变体解析了NSD3-PWWP1（残基247-398）结构域的晶体结构，并设计了一个新的截短体（残基263-398）用于X-射线晶体衍射。该截短体仅在化合物3（NMR; Kd=1700μM）存在时得到晶体。用这些晶体浸泡进一步得到化合物4（NMR; Kd=330μM）和化合物5（NMR; Kd=650 μM）的共晶。将化合物4和5作为SAR目录检索模板，使用内部建立的基于配体的虚拟筛选框架Morhits，对勃林格殷格翰化合物库进行虚拟筛选，对得到的601个虚拟筛选hit进行SPR单点筛选，后续测定了108个化合物的Kd。其中，活性最好的hit 8含有甲基咪唑核心，与检索模板结合在相同的结合位点，作为新的优化起点。
基于结构，研究人员对甲基咪唑类化合物进行优化，主要是甲基咪唑核心的4-和5-取代基部分。最终，在4位引入3,5-二甲基苯胺取代基，5位引入7-氟喹啉基得到活性最强的NSD3-PWWP1拮抗剂BI-9321。研究人员利用SPR和ITC两种方法证实了BI-9321的体外活性（SPR; Kd=166 μM, ITC; Kd=445μM）。BI-9321对PWWP蛋白家族、甲基赖氨酸结合结构域、甲基转移酶或激酶家族均没有明显的脱靶效应。BI-9321具有良好的药动学性质，适合作为化学探针在细胞环境研究NSD3-PWWP1的功能。同时，将结构相近但活性明显降低的类似物BI-9466作为阴性对照，排除非靶标相关效应。
进而，研究人员利用光脱色荧光恢复技术（FRAP）、细胞分级分离和生物发光共振能量转移（nanoBRET）等多种方法证明BI-9321可以进入细胞内，并与其靶标NSD3-PWWP1结合。接下来，研究人员研究了NSD3-PWWP1拮抗作用的治疗潜力。BI-9321可抑制MOLM-13和RN2细胞的增殖，而对AML细胞系HL-60和MV4; 11没有影响，表明NSD3-PWWP1结构域维持AML增殖的作用可能受限于细胞背景环境。与所观察到的抗增殖效应一致，BI-9321可降低MOLM-13细胞MYC mRNA水平。考虑到NSD3在调节溴结构域生物学中的作用，研究人员设想BI-9321是否可以增强BRD4拮抗作用。当联合处理时，BI-9321可增强JQ1在MOLM-13细胞系中的作用。这些数据表明NSD3-PWWP1抑制作为单一药物或与BRD4拮抗剂联用可作为NSD3依赖性肿瘤的治疗策略。
综上，研究人员开发了NSD3-PWWP1结构域的first-in-class化学探针BI-9321，证明了通过小分子调控PWWP结构域的可能性。在一开始没有蛋白结构和任何已知配体的情况下，研究人员应用基于片段筛选和基于结构的优化发现BI-9321。对不同活性范围的化合物采用不同的测定方法以及通过X-射线晶体结构的指导是hit高效优化的基础。化学探针BI-9321及阴性对照BI-9466有利于增加对PWWP结构域生物学功能的理解。
参考文献：
1. Böttcher, J., et al. Fragment-based discovery of a chemical probe for thePWWP1 domain of NSD3. Nat Chem Biol, 2019, 15(8): 822–829.
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