【First-in-class药设系列】靶向CDK12/13的抗三阴性乳腺癌小分子抑制剂发现
乳腺癌是全球女性群体中最高发的癌症。目前，乳腺癌的常规治疗手段是基于雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子2受体(HER2/ERBB2)的表达情况，以靶向阻断受体的功能来进行治疗。乳腺癌中有一个分支，其特征是缺乏ER、PR和HER2的过表达，即所谓的三阴性乳腺癌(TNBC)，三种受体检测都呈阴性，约占所有乳腺癌的20%，这些靶向治疗无法对其生效。对于TNBC患者来说，手术和化疗是最主要的治疗方法。尽管早期TNBC治疗效果良好，但与其他乳腺癌亚型相比，晚期乳腺癌的复发率更高，总体生存率更低。
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是丝氨酸/苏氨酸激酶，其活性取决于与细胞周期蛋白调节亚基的相互作用。最近的研究表明，CDK12与一组DNA损伤应答(DDR)基因的表达有关，CDK12促进了延伸率的增加，降低了在内部聚腺苷酸位点裂解的可能性，并增加了在3‘端聚腺苷酸位点裂解的可能性。许多DNA损伤修复基因，如BRCAness基因集中的成员，都具有多个内含子聚腺苷酸化位点，因此对CDK12抑制特别敏感。最近，来自Moffitt肿瘤研究中心的研究人员发现靶向抑制CDK12/13的小分子可以通过DDR效应来阻断三阴性乳腺癌的发生发展【1】。
DDR是一种进化保守的机制，通过检测DNA损伤，触发决定细胞命运的复杂反应，比如促进细胞周期阻滞和DNA修复，或在DNA损伤持续的情况下促进细胞死亡。许多化疗药物的抗癌活性依赖于DNA复制叉的折叠和DNA双链断裂的诱导，DDR蛋白突变的肿瘤对DNA损伤化疗尤其敏感。合成致死方法已经揭示了DDR通路缺陷肿瘤中的特定抗癌靶点，例如，缺乏BRCA的肿瘤细胞对聚ADP核糖聚合酶(PARP)的抑制高度敏感。因此，利用DDR 反应途径作为治疗途径的策略具有高度优先性。
SR-4835是一种选择性、强效的CDK12和CDK13抑制剂
研究人员从一个内部的激酶抑制剂库对筛选的阳性分子进行结构优化后获得SR-4835化合物，其对CDK12/13具有nM级别的亲和力。利用CDK12的X-Ray结构进行的分子建模研究预测，推测SR-4835通过与激酶的铰链区(tyr815、Met-816和Asp-819)的氢键相互作用，以与ATP竞争的模式结合CDK12。SR-4835在10μM浓度时在测试的450种激酶中，对CDK12/13具有高选择性；对于6种激酶有较弱的亲和力。Western Blot检测显示，SR-4835以100 nM的半最大有效浓度(EC50)阻断Ser2磷酸化。在细胞增殖研究中发现，TNBC细胞系对SR-4835高度敏感，中位EC50值在低纳摩尔范围（20-40nM）。这种敏感性在长期生长试验中也表现出来，其中SR-4835完全阻断了MDA-MB-231细胞的克隆生长和存活。在短期增殖试验中，SR-4835具有较好地对MDA-MB-231细胞的效力，对人初生胎儿结肠细胞的影响较小。
CDK12/13的抑制引起DDR蛋白的表达抑制
遗传学研究表明，CDK12控制编码DDR蛋白子集的基因的转录，这是由于CDK12依赖性地调控内含子聚腺苷酸化位点裂解。SR-4835处理MDA-MB-231细胞可在处理后6小时内降低DDR基因的表达，而其他与癌症相关的关键基因的表达不受影响。此外, 由γ-H2AX和PARP裂解的标志物变化可知，SR - 4835治疗引起DNA损伤,引发细胞凋亡。共聚焦显微镜免疫荧光观察MDA-MB-231细胞证实了，在SR-4835处理24h后引起了γ-H2AX亮斑的形成，与对照组相比不会引起DDR基因BRCA1的表达。彗星实验证实了SR-4835处理后DNA损伤的产生。因此，SR-4835处理会抑制RNA Pol II的CTD上的Ser2磷酸化，从而引起损害DNA损伤修复蛋白的表达，这伴随着肿瘤细胞中DNA损伤的增加和细胞死亡。
CRISPR编辑CDK12和CDK13与SR-4835在TNBC细胞中具有相似的作用机制
因为CKD12敲除后致死，所以研究人员使用对每个基因最有效的CRISPR sgRNA来分析短期感染后CDK12或CDK13缺失的表型表现。值得注意的是，CDK12和CDK13的下调降低了MDA-MB-231细胞的集落形成，它们的联合缺失抑制效果更强。CDK12和CDK13的双重下调导致了一些DDR mRNA和蛋白质水平的进一步抑制，如RAD51、ATR和SMARCC。研究人员对使用SR-4835或vehicle或CDK12和/或CDK13基因敲除后的细胞进行了RNA测序(RNA-seq)分析。通路分析显示，CDK12/CDK13敲低可显著抑制参与DNA修复、DNA重组和细胞周期检查点控制的基因，而显著上调的基因包括参与S、G2-M进展和凋亡的基因。此外，受CDK12和CDK13的药理和遗传沉默影响的差异表达通路有很高的一致性。SR-4835和双CDK12/CDK13基因敲除均可调控DDR相关基因的表达。在SR-4835处理的细胞中，BRCAness特征基因的表达被下调。
最近有研究表明，具有内含子聚腺苷酸化(polyadenylation,poly(A))位点的基因对CDK12抑制特别敏感。BRCAness基因具有多个多聚(A)位点，通过qPCR分析选定的BRCAness基因和GABPB1和CSTF2基因在其poly(A)位点之前或之后的区域，证实了其对poly(A)位点的直接影响。我们的结论是，靶向CDK12诱导了TNBC的BRCAness表型。
CDK12/CDK13抑制剂与DNA损伤药物或PARP抑制剂具有协同作用， 促TNBC细胞凋亡
研究人员认为通过CDK12/ CDK13抑制下调DDR蛋白会使TNBC细胞对DNA交联剂(顺铂)、拓扑异构酶I抑制剂(伊立替康)、DNA复制靶向制剂(阿霉素)和PARP抑制剂(奥拉帕尼)更敏感。将SR-4835和顺铂、奥拉帕尼、阿霉素和伊立替康在MDA-MB-231、HS578T和MDA-MB-468细胞系中浓度梯度联合给药，有很强的协同作用。而在FHC细胞中SR-4835与顺铂则无协同效果。与这些结果一致，γ-H2AX的水平和TNBC细胞的凋亡通过这些联合治疗在肿瘤细胞中得到了增强。从表达研究中可以看出，经过SR-4835处理后，ATM和RAD51蛋白水平被抑制。
CDK12/CDK13抑制剂与DNA损伤疗法协同，抑制TNBC肿瘤的生长
为了检测SR-4835的抗肿瘤活性，研究人员使用了来自的原位病人来源的异种移植(PDX)模型(PDX4013)，样本来自对达沙替尼和多西紫杉醇治疗耐药的TNBC患者。根据药代动力学分析，确定了SR-4835的口服生物利用度。当肿瘤体积达到100 mm3时，将动物随机分为4组，给药安慰剂，SR-4835、顺铂或SR-4835与顺铂联合用药。使用SR-4835或顺铂治疗的小鼠与使用安慰剂药物治疗的小鼠相比，肿瘤生长明显下降。联合治疗引起了肿瘤的快速消退。
终点研究确定了在SR-4835处理或联合用药时，DDR基因 (mRNA和蛋白水平上)的表达均降低，而γ-H2AX的蛋白水平在所有条件下均高于安慰剂组小鼠。免疫组化(IHC)分析证实γ-H2AX在双重处理时表达水平上升。在所有药物治疗组中，增殖(KI67+细胞)减少，凋亡（裂解Caspase-3）增加。单独的SR-4835治疗并没有引起体重下降。此外，在终点分析中没有观察到血细胞计数的显著变化，对小鼠组织的组织学分析表明，SR-4835对小鼠无不良影响。总之，小鼠对SR-4835有很好的耐受性，其没有明显的总毒性问题。单独使用SR-4835和与伊立替康联合使用的疗效也通过第二组TNBC (PDX3887)临床前PDX模型进行了测试，是由一名对5-氟尿嘧啶耐药的患者的原发性BRCA1突变瘤建立的。用SR-4835治疗明显抑制了肿瘤生长，伊立替康能有效降低肿瘤生长，20%的小鼠肿瘤完全消退(2 / 10)。值得注意的是，SR-4835和伊立替康的组合更为显著，其中50%的小鼠没有可检测到的疾病。与PDX4013模型结果一致，SR-4835处理降低了DDR基因的mRNA和蛋白水平，此外，经western blot或IHC终末分析观察，DNA损伤和细胞死亡诱导在联合处理的动物中最为显著。综上所述，这些数据证明SR-4835是治疗TNBC的有希望的候选药物，与DNA损伤剂联合使用时可以有较好的疗效。
尽管TNBC患者对目前的化疗有反应，但一旦复发，病情进展总是很快。铂盐有望用于临床试验，PARP抑制剂有望用于BRCA缺陷的转移性乳腺癌已经确定了利用DNA修复缺陷作为这类乳腺癌的靶向治疗的潜力。事实上，研究界目前正在进行大量工作，以确定BRCAness表型分布在多种恶性肿瘤中。由此可见，确定新的目标和同源重组(HR)的调节剂，以增强PARP抑制剂和铂盐的疗效和扩大其用途是治疗领域的一个重点。CDK12控制核心DDR基因的表达，而沉默CDK12与PARP抑制剂联用是合成致死的，因此CDK12的小分子抑制剂作为抗癌药物是非常有前景的。
[1] Victor Quereda, Simon Bayle, Francesca Vena,Sylvia M. Frydman, Andrii Monastyrskyi, William R. Roush, Derek R. Duckett. Therapeutic Targeting of CDK12/CDK13 in Triple-Negative Breast Cancer, CancerCell, 2019, doi: 10.1016/j.ccell.2019.09.004