【变构原创系列】抗耐药新希望—变构药物与正构药物联合用药
历史上，大部分的药物都靶向蛋白的正构位点，随之而来的耐药性不可避免地会影响他们的治疗效果，给药物开发带来了极大的挑战。利用变构药物与正构药物的联合用药则为对抗耐药性提供了一个革命性的新思路。变构药物靶向结构上不同于正构位点的口袋，能够在耐药性靶点中改善甚至提高传统正构药物的药效。我们最近系统分析了利用联合用药对抗耐药性方面的策略及最新进展(“【TIP】变构-正构”联合的抗耐药策略“)，着重阐述了这些联合疗法的作用模式以及具体的结构机制。这种策略将会为解决耐药性这一难题提供一个崭新的解决方案，并且会对未来的临床治疗具有指导性意义。今天就这个问题在这里展开和大家进行讨论。
耐药性一直以来都给药物开发以及医疗卫生领域带来了极大的挑战，它也因此成为了现代生物医药领域亟待解决的难题之一。耐药性的产生是一个极为复杂的过程，它包含了分子，信号通路乃至整个生物体层面的改变。根据耐药性的产生机理，它们可以被划分为“靶标依赖性的耐药性”以及“通路依赖性的耐药性”。其中，前者主要是由于靶点本身的改变，如突变等诱发产生耐药性；后者则主要是由于靶点相关的信号通路的改变而导致耐药性。这两种耐药性分别有着不同的解决方法，例如，基于结构的药物设计与优化一般会更适用于“靶标依赖性的耐药性”；而多手段联合用药则更多被应用于对抗“通路依赖性的耐药性”。有关对抗耐药性的手段，前人已近进行了详尽的探索与讨论，但是绝大部分只是针对于药物分子的优化，或者是通过多种疗法的并行使用来解决耐药性的问题。
变构药物是药物研发领域最新的一大方向，它能够通过影响药物靶标自身的药化性质，改善甚至提高正构药物的药效。并且相比起传统的单一药物的手段，多种药物联合用药能够实现更广谱的药效，并且可以达到药物之间协同作用，相互促进，实现更好的治疗效果。因此，利用变构药物与正构药物二者联合用药为解决耐药性的问题提供了前所未有的可能。在此，我们将首先介绍多个利用上述联合用药手段对抗耐药性问题的经典例子，阐明他们的作用机理以及未来的发展方向；然后我们还将讨论联合用药手段现存的问题与挑战，以及未来有望优化以及提高的可能方案。我们介绍的联合变构药物以及正构药物进行治疗的对抗耐药性的手段，将为以后解决耐药性难题以及临床药物设计提供指导。
临床试验编号 | 正构位点及药物 | 变构位点及药物 | 对应疾病 | 研究阶段 |
NCT01271920 | ||||
NCT00096486 | EGFR (Gefitinib) | mTOR (Everolimus) | 肺癌 | 一/二期 |
NCT02321501 | ALK (Ceritinib) | mTOR (Everolimus) | 头颈癌及肺癌 | 一期 |
NCT02081378 | BCR-ABL (Imatinib/Nilotinib/Dasatinib) | BCR-ABL (Asciminib) | 白血病 | 一期 |
NCT01392521 | PI3K (Copanlisib) | MEK1/2 (Refametinib) | 肉瘤 | 一期 |
NCT01973309 | FZD receptor (Vantictumab) | Tubulin (Paclitaxel) | 乳腺癌 | 一期 |
NCT01344031 | Aromatase (Anastrozole) | Akt (MK-2206) | 乳腺癌 | 一期 |
NCT01705340 | HER2 (Trastuzumab), EGFR (Lapatinib) | Akt (MK-2206) | HER2阳性乳腺癌及肠癌 | 一期 |
NCT01783171 | CDKs (Dinaciclib) | Akt (MK-2206) | 胰腺癌 | 一期 |
NCT01251861 | Androgen receptor (Bicalutamide) | Akt (MK-2206) | 膀胱癌 | 二期 |
NCT00848718 | EGFR (Erlotinib) | Akt (MK-2206) | 实体瘤 | 一期 |
NCT01042379 | HER2 (Trastuzumab) | Akt (MK-2206) | 乳腺癌 | 二期 |
NCT01295632 | mTOR (Ridaforolimus) | Akt (MK-2206) | 晚期癌症 | 一期 |
NCT01243762 | IGFR1 (Dalotuzumab) | Akt (MK-2206) | 恶性肉瘤 | 一期 |
NCT01072175 | BRAF (Dabrafenib) | MEK1/2 (Trametinib) | BRAF突变的黑色素瘤及肠癌 | 一期 |
NCT01958112 | Akt (Uprosertib) | MEK1/2 (Trametinib) | 子宫癌 | 二期 |
NCT01248858 | mTOR (Omipalisib) | MEK1/2 (Trametinib) | 实体瘤 | 一期 |
NCT01155453 | PI3K (Buparlisib) | MEK1/2 (Trametinib) | 晚期实体瘤 | 一期 |
NCT01476137 | Akt (Afuresertib) | MEK1/2 (Trametinib) | 癌症 | 一期 |
NCT01750918 | BRAF (Dabrafenib), EGFR (Panitumumab) | MEK1/2 (Trametinib) | 癌症 | 二期 |
NCT02900664 | PD1 (PDR001) | MEK1/2 (Trametinib) | 肠癌，三阴性乳腺癌，非小细胞肺癌 | 一期 |
NCT03428126 | IgG1к (Durvalumab) | MEK1/2 (Trametinib) | 消化系统恶性肿瘤 | 二期 |
NCT03087448 | ALK (Ceritinib) | MEK1/2 (Trametinib) | 非小细胞肺癌 | 一/二期 |
NCT00996892 | PI3K (Pictrelisib) | MEK1/2 (Cobimetinib) | Dual PI3K/K-Ras mutant colorectal cancer | 一期 |
NCT01562275 | Akt (Ipatasertib) | MEK1/2 (Cobimetinib) | 肉瘤 | 一期 |
NCT03989115 | SHP2 (RMC-4630) | MEK1/2 (Cobimetinib) | 实体瘤 | 一期 |
NCT01271803 | BRAF (Vemurafenib) | MEK1/2 (Cobimetinib) | 恶性黑色素瘤 | 一期 |
NCT01988896 | PD-L1 (Atezolizumab) | MEK1/2 (Cobimetinib) | 实体瘤 | 一期 |
NCT01495988 | VEGF (Bevacizumab) | MEK1/2 (Cobimetinib) | 黑色素瘤 | 二期 |
NCT03202940 | ALK (Alectinib) | MEK1/2 (Cobimetinib) | 非小细胞肺癌 | 一期 |
NCT02143466 | EGFR (Osimertinib) | MEK1/2 (Selumetinib) | 非小细胞肺癌 | 一期 |
NCT02025114 | EGFR (Gefitinib) | MEK1/2 (Selumetinib) | 非小细胞肺癌 | 一期 |
NCT00777309 | EGFR (Erlotinib) | MET (Tivantinib) | 非小细胞肺癌 | 二期 |
NCT01513174 | EGFR (Gefitinib) | PARP (Olaparib) | 非小细胞肺癌 | 一/二期 |
BCR-ABL激酶
进一步的质谱实验揭示了BCR-ABL的正构位点的结构会受到GNF-2结合的调节影响，而细胞生化实验以及后续的小鼠移植瘤模型实验也证实GNF系列的化合物与经典的正构药物如格列卫，尼诺替尼等联用的时候，能够有效的抑制此前具有耐药性的BCR-ABL突变体，这提示着利用变构药物和正构药物的联合用药能够有效的改善具有耐药性突变的白血病患者的治疗。
NS5A
丙肝感染一直是公共卫生领域的一大难题，全球受丙肝病毒感染的人据保守估计将近有1.5亿人。丙肝病毒当中，NS5A蛋白在其致病过程中扮演着重要的角色，它介导了病毒的复制以及对于宿主的侵染等过程，因此也被认为是抗病毒药物开发的重要靶点。
为了解决上述耐药性问题，Sun等人研发出一个变构分子Syn-395。他们首先发现Syn-395可以变构地结合到NS5A上，与正构药物Daclatasvir联合发挥作用。由于缺乏晶体学的研究，基于生化实验研究者认为Syn-395会结合在Daclatasvir的正构位点附近，增强正构药物对于NS5A整体构象的影响。进一步的实验则发现，上述的变构药物与正构药物同时用药的时候，Daclatasvir正构药物的药效可以被提高超过1000倍，这也为后续的抗病毒，尤其是抗丙肝的药物开发与设计提供了一个颇具潜力的思路。
EGFR
表皮生长因子受体（EGFR）一直以来都是非小细胞肺癌的一个重要药物靶点。针对EGFR已经有很多药物分子被报道。其中，第一代的针对EGFR药物主要是靶向EGFR底物口袋的正构竞争性抑制剂，如吉非替尼，厄罗替尼等。正构EGFR药物普遍对于野生型的EGFR以及常见的L858R突变都有效，因此也成为非小细胞肺癌的一线疗法。但是新型T790M的出现形成的双突变体（L858R/T790M）会极大的提升EGFR底物ATP的亲和力，导致正构药物的失效，因而产生耐药性。
为了解决耐药性的问题，To等人提出了正构药物Osimertinib与他们新发现的变构药物JNJ-04-125-02联合用药的方案。研究者首先利用生化实验以及晶体学的研究证实了上述两个药物分子能够共同结合到EGFR的突变体上，并且变构分子JNJ-04-125-02能够通过诱导EGFR蛋白的构象变化，使其对于正构药物Osimertinib的结合与抑制更易感，因此克服了由于突变所引起的耐药性问题。细胞实验则显示，二者的联合使用能够有效提升对于癌细胞的抑制效果；而体内实验则发现，联合用药能够更有效的清除肿瘤，延长疾病模型的生存时间。总而言之，利用变构药物JNJ-04-125-02与正构药物Osimertinib的联合用药能够有效克服EGFR突变所带来的耐药性问题。
CFTR
变构药物与正构药物的联用同样被应用在囊性纤维化的治疗当中，它们主要能够靶向参与囊性纤维化发病的其中一个重要蛋白CFTR而发挥功效。CFTR的结构包含两个核苷酸结合结构域（NBD1, NBD2），两个跨膜结构域（MSD1, MSD2），以及一个调节结构域，这些结构域相互之间变构偶联，相互调节，在上皮细胞的细胞上发挥着离子通道的功能。CFTR蛋白上最常见的一个致病突变是F508del（F508位的deletion），它会导致CFTR蛋白错误折叠，影响其正常的功能，进而导致疾病发生。利用药物分子纠正CFTR蛋白的错误构象，恢复其正常功能是治疗囊性纤维化的一大方向。此前已经有一个正构药物VX-809被报道并被应用到临床上囊性纤维化的治疗当中，并且它对于上述的致病突变体蛋白F508del也有良好的药效。VX-809能够增强CFTR蛋白内部结构与之间的相互联系，稳定整体的蛋白质构象，恢复其正常功能。但是，最新的研究也发现，新型突变如P67L和S492F依然会诱导针对VX-809的耐药性的产生。
因此，最近，Veit等人提出一个三联用药方案，利用VX-809正构药物与另外两个变构药物协同用药，对抗CFTR的耐药性突变。研究者们首先大规模筛选了超过600000个化合物，并从中发现了39个有良好调节活性的候选分子。基于分子结构以及理化性质，这些小分子被进一步分为多组。后续的生化实验则发现，将VX-809和3151-系列以及4172-系列的分子联合使用，能够有效提高对于致病蛋白CFTR的药效，三联用药能够恢复该蛋白的正常结构以及表达水平，使之能够正常发挥功能。虽然两组变构分子的具体结合位点尚未被解析，但是利用表面等离子共振（surface plasmon resonance）技术，研究人员认为它们会通过不同的变构机制发挥功效。其中，3151-系列的化合物会和NBD2及其界面发生相互作用，而4172-系列的化合物则会靶向NBD1，变构药物与CFTR结合之后都能够恢复蛋白的正常结构，维持其正常功能。而在小鼠模型的体内实验中，上述的三联用药疗法也被证实具有良好的效果，它们能够共同缓解疾病模型中的囊性纤维化症状。综上所述，利用变构药物与正构药物的三联用药方案在囊性纤维化的治疗当中具有着很大的潜力，但是对于其详细的作用机理，则还需要进一步的探索。
未来展望
在现代生物医学当中，耐药性问题依旧是临床以及基础研究中的头号难题，它影响着从抗感染到抗肿瘤等一系列领域。解决这一难题需要多方面多学科的协同合作。变构药物作为结构生物学以及药物化学领域的最新研究成果之一，为对抗耐药性难题提供了前所未有的机遇。变构药物主要能够通过两种渠道来帮助对抗耐药性。一方面，变构药物可以和正构药物一起结合的同一个药物靶点上，随后变构药物可以调节靶点蛋白的性质，使失效的正构药物重新起效。另外一方面，变构药物也可以被利用来调节和耐药性相关的信号通路，由于其具有高选择性，低副作用的优势，所以它们在这个方向上同样大有可为。结合变构药物与正构药物联合用药的手段，将有望解决一系列一直存在但难以解决的耐药性难题，提高传统正构药物的治疗效果。到目前为止，已经有大量联合用药方案被发现与报道，其中也有很大一部分已经逐步开始进入临床研究的阶段（表1）。在这些疗法当中，实际上只有一例是变构与正构药物共同靶向同一个靶点蛋白的，即前文提到的BCR-ABL激酶的案例，而其他的方案则都是针对耐药性靶点及其相关的信号通路所设计的。在这一系列的耐药性信号当中，目前已有的药物研发又主要关注于Ras-Raf-MEK-ERK通路以及PI3K-Akt-mTOR通路，这也实际上和一直以来的基础与临床研究结果相吻合。
基于对已经进入临床阶段的联合用药方案的分析，我们首先注意到，实际上，能够进入临床研究阶段的变构药物数目相对而言仍然很少，这也反映了利用蛋白质变构效应进行药物设计与开发的困难。虽然理论上蛋白质上几乎除了活性位点（即正构位点）以外的部分都有成为变构位点的可能，但是对于很大一部分和疾病相关的蛋白，我们对其变构效应，尤其是具体的变构位点仍然知之甚少。比如说对于介导肺癌发病的RET激酶，虽然已有报道一种正构药物Vandetanib能够靶向这个蛋白，但是相应的S904F突变会产生耐药性，而有关RET蛋白的变构位点到现在仍然未被报道。因此，如何更有效准确的发现新的变构位点，将成为联合用药疗法中不可或缺的一个重点。
在发现靶点后，如何进行合理的药物设计则是发展联合疗法的另一个难点。以往大多数的变构药物都是随机被发现，而目前，随着变构领域的研究逐步推进，生物信息学等方面的工具将为变构药物设计与开发提供巨大的帮助。诸如AlloDriver或是AlloMAPS等软件能够被用于评估耐药性突变对于蛋白质构象以及内部结构性质等的影响；而AlloFinder和AlloSite等软件则可以用来识别全新的变构位点并用于后续的药物设计与优化。这些计算手段的应用，结合实验技术等的进步，将会有效地指导变构药物的设计与开发，推进变构药物与正构药物联合疗法的发展。
另外一个联合用药方案设计中的难点则是如何选择合适的药物组合。历史上，类似siRNA筛选以及大规模化合物库筛选等方法已经被应用到挑选合适的联用方案上面。但是它们不可避免地受限于耗时长，花费高，精度低等缺点。和计算生物学以及系统生物学等手段将有望成为这些实验手段良好的互补。针对现有的海量多组学数据，利用多样化的数学模型进行整合与分析将有望实现更高效和准确的筛选与测试，这将有助于对于潜在药物组合方案的挑选，对于用药方案具体效果的量化分析，并且还有可能预测全新的用药方案以及其可能的影响。此外，利用这样系统生物学模型的整合与分析，还能够及时发现潜在的药物相互作用以及随之而来的药物毒性等副作用。
综上所述，虽然在对抗耐药性的征途上依旧有很多艰难险阻，但是利用变构药物和正构药物联合用药的策略已经在这一关键领域上有所建树。因此，我们对未来这一方法的应用以及推广依旧保持谨慎而乐观的态度，我们相信，它将会为成为对抗耐药性的重要武器。
参考文献
Ni Duan, Li Yun, Qiu Yuran, Pu Jun, Lu Shaoyong, Zhang Jian. Combining Allosteric and Orthosteric Drugs to Overcome Drug‐ Resistance. Trends in Pharmacological Sciences, 2020, In press.