【First-in-class药设系列】抗衰老靶点识别及健康老龄化药物的研发进展

当前全球人口老龄化逐步加重，一方面老龄化反应了人类在改善营养、生活环境、卫生和保健方面取得的进展，另一方面老龄化是大多数常见的人类慢性疾病的最大危险因素。因此，将健康延长至老年，即延长人类健康寿命是制定预防、减轻或扭转多种与年龄有关疾病的合理目标。目前，应用遗传学方法已经成功延长了酵母、蠕虫、果蝇和啮齿动物等模式生物的寿命。这些研究可以引导我们识别调控寿命的保守基因和通路，反过来也能引导我们发现在这些通路中延长寿命的药物靶点。最近的遗传研究提示，特定的基因或通路可能调节人类寿命及健康寿命。为了推动这一发现，以鉴定能缓解人类衰老的靶点，需要一种系统的方法来识别有助于人类长寿和健康衰老的关键基因和途径。

    通过人类中的长寿个体的存在，可以确定人类以相对良好的健康状态可以度过九十岁，并在没有长期疾病的情况下结束生命的生理可行性。基于这一视角，我们今天讨论如何基于长寿个体的极端表型来识别遗传变异，为理解健康衰老的生理学和开发预防、改善或缓解多种年龄相关疾病的疗法提供药物研发的靶点。

一、模式动物寿命延长的机制

在模式生物如线虫类的中，寿命可以通过单个基因的突变来显著延长。例如，人胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)受体( IGF-1 receptor, IGF-1R)的线虫同源基因daf-2上的突变可抑制胰岛素或IGF-1信号(Insulin-like growthfactor 1 signalling, IIS)，从而使线虫的寿命将近翻倍。由于IIS在营养传感中的作用，在酵母、果蝇和老鼠等其他模式生物中，对IIS修饰也会影响其寿命。事实上对IIS抑制的影响与在多个物种延长寿命的饮食控制方法有诸多相似之处。此外，对其他生长、代谢和营养感觉途径的靶点干预也能延长寿命，例如抑制mTOR(mechanistic target of rapamycin，mTOR)或激活AMPK(AMP-activated protein，AMPK)。这些长寿途径是相互交织在一起，或者通过其参与的效应蛋白直接相互作用，或者通过它们的网络通路及应激反应相互作用。这些作用也提示了衰老代谢与分子/细胞防御损伤之间的关联。

    利用药理学对健康寿命进行研究可以建立寿命干预的理论基础。这方面比较深入的例子是雷帕霉素对mTOR激酶活性的抑制，其大大增加了小鼠以及其他模式生物的寿命。基于此，10年前美国国家衰老研究所(theUS National  Institute on Aging， NIA)曾提出干预测试计划(theInterventions Testing Program，ITP)。该计划由三个中心组成，负责测试药物对小鼠寿命的影响。到目前为止，ITP已经发现，雷帕霉素、17α-雌二醇、去甲二氢愈创木酸、阿卡波糖、高剂量阿司匹林和低剂量二甲双胍的长期使用能延长寿命，但通常对雄性小鼠的作用弱于雌性小鼠。以二甲双胍为例，它不仅针对已知的衰老过程，而且有效地保护人类免受多种年龄相关疾病的影响。进而，二甲双胍治疗衰老(The Targeting Aging with Metformin，TAME)已开展临床试验，旨在确定二甲双胍是否能延缓老年人年龄相关疾病的发生，并为美国食品和药物管理局考虑将衰老作为一种疾病指征铺平道路。

二、人类衰老的遗传学进展

    尽管在识别模型生物提高健康寿命的基因和途径方面取得了进展，但这些基因与途径是否与人类相关仍是亟待解决的关键问题。同时，是否存在无法用模式动物研究的对人类衰老至关重要的其他途径尚未可知。事实上，人类寿命极长，在大多数模型生物中，与年龄有关的主要疾病较为罕见，如阿尔茨海默病和心血管疾病等。因此，人类遗传学作为工具发挥针对衰老治疗的研究具有极大的潜力。研究可以从长寿的人出发，特别是那些极少的能没有疾病并活到100岁或更老的人，即百岁老人，使用自然突变而非基因工程定向突变个体来鉴定调节寿命的基因和途径。

    即使在现代社会条件下，人类的自然寿命也存在很大差异。尽管饮食、身体活动、健康习惯和心理社会因素在内的环境因素很重要，但人类寿命受遗传的影响仍不可忽视。这一观点可以通过比较百岁老人的兄弟姐妹和与同年代寿命70岁人的兄弟姐妹的存活率来证明。通过研究长寿人口的亲缘关系，并将他们的生存与来自同一地理区域的出生队列进行比较，以及比较同异卵双胞胎的死亡也可以证明遗传在人类寿命中的作用。这些研究表明，人类寿命的差异有25%可能是由遗传因素造成的，但在老年人中，遗传因素对寿命的影响更加明显(35%)。事实上，百岁老人的后代患与年龄有关的疾病的几率更低，而且在许多代谢和免疫相关参数方面，与年龄和性别相同的对照组相比，百岁老人的后代更健康或更“年轻”。

因此，探索调控人类极端寿命的遗传因素将为人类长寿和抗病机制提供深刻见解，并可能进一步发现能促进健康老龄化的药物和其他治疗策略的新靶点。人类寿命作为表型，很可能受到不同类型的遗传变异以及它们之间相互作用的影响。当前，与人类寿命相关的常见变异已经成为全基因组关联分析(Genome-wide association studies，GWAS)研究的焦点。GWAS研究已经鉴定了50多个具有全基因组意义的长寿相关遗传位点，这表明人类长寿是一种多基因性状，受许多的小至中等效应变异的影响。然而，GWAS研究也有三个局限性。首先，不能解释大多数包括罕见变异在内的遗传变异影响的复杂性状。第二，从GWAS信号中识别出具有因果的基因突变仍然困难。第三，人类寿命的GWAS研究目前主要是基于欧洲人群。为了充分理解人类老龄化的遗传结构，需要通过在祖先不同的队列之间交叉验证遗传变异来研究祖先多样化的群体，同时避免群体分层。

三、抗衰老靶点的识别与药物研发

   寿命极长的个体基因组包含了健康衰老和长寿的生物学蓝图。极端长寿是是研究调节健康寿命和寿命的遗传变异的理想表型。由于百岁群体的规模一般在数百人，科学家通过对具有极端表型的个体进行测序来发现具有较大影响的罕见变异。利用这种策略，发现了前蛋白转换酶枯草素/kexin9型丝氨酸蛋白酶(Proprotein convertasesubtilisin/kexin type 9 serine protease，PCSK9)这一成功案例。PCSK9是一种通过调节低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)受体降解而参与胆固醇代谢的酶，被认为是降低血浆低密度脂蛋白胆固醇和心血管疾病风险的药物靶点。针对单个家族PCSK9突变引起的常染色体显性高胆固醇血症研究首先将PCSK9与胆固醇代谢联系在一起。健康个体中随后也发现了由于PCSK9复合杂合子功能缺失突变而缺少循环的案例。这些发现表明，极少数PCSK9功能丧失突变的人在一生中没有由于极低胆固醇血症而产生不良影响，并且心血管疾病的风险显著降低，这为PCSK9抑制剂的开发提供了信心。近来，对PCSK9的抗体已经通过临床试验被批准，另一种RNA干扰药物正在接受监管审查。与PCSK9突变类似，编码胆固醇酯转移蛋白(CETP)的基因中罕见的突变被鉴定出与加速动脉粥样硬化有关，从而带动了当前CETP抑制剂的开发热潮。

    极端长寿研究可以采用与PCSK9例子类似的方法，通过进行全基因组或全外显组测序来鉴定在百岁老人中富集的与极端长寿相关的基因。一般来说，性状相关的罕见变异的识别由于缺乏足够的统计效力是非常困难的。为了解决这一问题，除了使用特殊的寿命作为极端表型外，还必须采取多个步骤来减少错误发现提高统计效力。如(1)整合互补基因组数据的统计分析;(2)在第二组长寿队列中确认一种罕见的变异；(3)在大规模对照人群中检查变异的确实和损耗；(4)通过与健康和长寿有关的各种参数验证所确定基因和变异的生物学功能。将这些长寿个体进行基因分析的步骤结合起来，有助于发现与长寿相关的潜在药物靶点的罕见基因变异。当前，基于测序研究，已经发现了富集在百岁老人中IIS途径中罕见的保护性等位基因。这些与寿命相关的罕见等位基因导致细胞模型中的IIS降低，从而证明了无脊椎动物模型与人类之间IIS通路的保守性，并证明了变异与寿命之间存在正相关。另外，最近一项临床前研究表明，靶向IGF- 1R的单克隆抗体显著改善了晚年雌性小鼠的健康寿命和寿命，这也验证了从人类遗传学出发快速转化进行药物开发的可行性。

为了获得药物研发的靶点，鉴定了长寿个体的罕见变异之后，还需要验证这些变异的功能，仅根据序列信息来解释变异具有局限性。基于蛋白-蛋白相互作用来分配变异的功能是其中一种成功的方法。许多蛋白质具有多向性，并通过与多种蛋白质相互作用而发挥不同的功能。同一基因中影响不同蛋白质相互作用的突变往往会导致临床上不同的结果，而影响相同相互作用的突变，往往会导致相同的疾病。因此，蛋白质相互作用网络可以深入了解致病突变的分子机制并有助于识别新的候选基因和突变。平均而言，一种人类蛋白质与相互作用网络中五个以上的其他蛋白质会发生相互作用。因此，确定由罕见的错义变异引起的特定于相互作用的干扰是非常重要的。

一种被称为整合蛋白质相互作用扰动(Integrated protein interactome perturbation，InPOINT)筛选的高通量流程被用于识别造成蛋白质稳定性和蛋白质相互作用网络变化的因果编码变异识别（如，错义突变等）。简单来说，InPOINT流程结合了不同的高通量方法：一种以大规模平行的方式产生特定的突变克隆的方法（Clone-seq）；一种基于荧光来确定变异体对蛋白质稳定性的影响和蛋白质相互作用的分析（Stability testing）。结合多种分析可以确保预测的质量，并实际消除假阳性结果。然后，对高通量分析中排序靠前的功能变异进一步检验，测试它们对细胞结果的影响，例如对应激的抵抗力。这种应激测试可以在人类细胞中并通过基因编辑技术引入变异以相对高通量的方式进行。这些变异的分子效应也可以在人类诱导的多能干细胞 (induced pluripotent stem cells，iPSCs)及其后代中进行研究，以确定序列变异在各种细胞型中的功能影响。

最后，通过在啮齿动物中将罕见变异引入编码基因的一个等位基因，可以验证候选的罕见变异对健康寿命的影响。但如果该变异位于基因的非编码区域，那么构建小鼠模型以直接验证该变异对寿命的影响非常困难。此时可以通过使用小鼠杂合子来确定该基因的低表达或过度表达的影响；或者携带该基因的额外拷贝，来检查该基因在寿命和健康寿命中的作用。最后的步骤是发现新的化合物或现有的药物，从药理学以模拟该变异对其同源途径或细胞功能的影响。可以通过建立细胞中的表型或荧光报告检测，来筛选能模拟遗传变异效应的化合物。

四、抗衰老总结和未来展望

近年来，人类具有极端表型的几个突破性遗传发现导致了快速和成功的药物开发。在这一视角下，我们分析了将这一概念应用于新的基于基因的抗衰老疗法开发的可行性，即通过干涉控制衰老的途径来增加人类的健康寿命。遗传是长寿的一个关键因素，这使得长寿的个体特别适合作为发现基因靶标的来源，从而为调节人类中保守和非保守的衰老途径的新药物方法提供新的途径。在模型生物体中，调节这样的途径已被确凿地证明可以延长寿命和健康寿命，但其他可能针对人类物种的途径仍有待发现。考虑到越来越多的来自人类群体(包括百岁老人)的全外显子组和全基因组测序数据，快速识别影响健康老龄化表型的罕见编码变异将在未来成为可能。

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参考文献

Zhang, Z.D., Milman, S., Lin, J. et al. Genetics of extreme humanlongevity to guide drug discovery for healthy ageing. Nat Metab 2, 663–672(2020). https://doi.org/10.1038/s42255-020-0247-0