诺奖膜片钳专题| 探索神经元交流的发声元件
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撰文： insoulter
编辑：X君
200多年前，意大利的解剖学家Luigi Galvani在一端驾于高空的金属线在雷电产生时刺激蛙神经肌肉标本，意外发现肌肉能够收缩；隔天试图观察晴天肌肉的反应情况时，却意外地发现用铜钩将标本挂于凉台的铁栏杆时，肌肉也会收缩。这一系列意外都是在神奇的凉台发现的，所以被称为“凉台实验”；并由此认为生物体内存在“生物电”。
Galvani的实验传到了物理学家Alessandro Volta的耳朵里，引起了他的极大兴趣，但Volta不相信生物电，就开始一边和Galvani争论，一边努力做有关电的实验，最终用金属和电解液发明了第一个现代的化学电池—伏特电堆。（没错，表示电压的伏特（Volt）就是用来纪念Volta的。）
而这边Galvani也积极应战，1794~1797年通过大量实验，发现神经与肌肉组织的完好表面与损伤面同时接触，也会引起该神经所支配的肌肉产生收缩；这种效应与通过金属用电流刺激神经相同，为生物电的存在提供了有力的证据。
伽伐尼和伏打的论战，不仅奠定了电生理学的基础，而且极大地推动了电子学、半导体、生理学及电化学的发展。
（这个故事告诉我们什么？走在最前沿的科学一定是交叉学科，学科的交（争）流（论）会推动科学的不断进步。)
而1827年，由于电流计的发明，Du Bois Reymond测定了肌肉完好部分和损伤部分的电位差,并发现损伤部位为负值。当动物电这一现象愈发浮出水面时，科学家的兴趣被极大地点燃和鼓舞；然而面对#神经细胞如何产生电流#这一问题时，科学家再次陷入捉襟见肘的境地。
没有金刚钻揽不了瓷器活
谈起科学界的明星动物，会想起什么？斐波那契的兔子、摩尔根的果蝇、桑代克的猫、托尔曼的老鼠、斯金纳的鸽子、巴甫洛夫的狗，以及现代神经科学记忆领域坎德尔的海兔…
当这些科学家接受采访时，常常会说这些奖项应该颁给它（猫、果蝇、海兔等）。这不仅仅是科学家们一句简单的幽默，更是因为如果不是找到了合适的模式动物，可能距离发现伟大现象还有很长的弯路要走。
神经细胞的动作电位的发现也是如此。
而科学家们发现了神奇的生物电现象时，尽管电流计、示波器、电流断续器的发明使得人们看清楚了动作电位的真身，但认识神经细胞动作电位还是太难了——细胞和轴突只有微米级别，太小了！
真正的突破来自John Z.Young发现了枪乌贼。枪乌贼形状神经节许多细胞的轴突相互融合，形成了直径1mm、长达百余毫米且无髓鞘的巨轴突。这一“天赐的绝妙标本”的引入，使得科学家对动作电位的认识进入了“工业革命”时代。
#题外话，一种产于智利的大鱿鱼（Humboldt squid ）甚至以一己之力催生了一个实验室的诞生。这种鱿鱼的轴突更粗，在测量动作电位等方面有远超其他鱿鱼的表现。当时快递业务还没有现在这么发达，身靠鱿鱼产地对于实验室来说是一个巨大的优势，这也让智利的蒙特马尔实验室成为了当时世界上一流的电生理学实验室。
但是，可能由于厄尔尼诺现象与海洋酸化的影响，1970年夏天，这种鱿鱼神秘消失于智利海域之后，科学家们也纷纷离开了智利，实验室随之衰落。
工欲善其事必先利其器
Huxley 和 Hodgkin，Cole和Curties将毛细玻璃管充入盐水或细金属丝，插入鱿鱼犹如意面一般粗的巨轴突，进行了最早的细胞内记录实验；
1948年，芝加哥大学的Gilbert Nin Ling(凌宁)与其导师使用拉制的方法制成了直径小于0.5μm的玻璃微电极；从而可以对小细胞进行低损伤性穿刺，引导记录细胞内电位；
1949年，Cole和Marmont创造了电压钳技术，随后Hodgkin和Huxley对其加以改，采用两根金属电极，一根用于监测膜电位，另一根用于反馈性地注射电流，来抵消跨膜电流造成的膜电位变化，从而测定了动作电位及产生机制；并赢得了1963诺贝尔医学与生理学奖。
这种记录生物电信号来研究生物功能的技术，即电生理（Electrophysiology）。假如把大脑的活动当做一次晚会，那么神经细胞产生的每一个动作电位都是一次发声，当把记录电极放在头皮上时，我们听到的是一群神经元的合唱/和声（脑电记录）；当记录电极放在脑内的某个神经细胞旁时，我们听到它附近的几个神经元的声音，如果足够靠近，我们也能听清单独这个神经元的歌唱（胞外记录）；而当再靠近一点，甚至把电极插在细胞内时，我们听到的就完全是这个细胞的声音了（胞内记录）。
正如Huxley 和Hodgkin 通过胞内记录到单个动作电位一般，这是细胞的一次发声。然而科学的探索是无止境的，“发声”的元件是什么？
单个离子通道的记录
通过《诺奖膜片钳专题| 从RC电路到H-H模型》，我们知道动作电位的电学基础是钠、钾离子通道的开放和关闭引起的电位变化；但这其实也是整片膜的离子通道变化总和，是否有一种方法可以精致到能听清某一个离子通道的声音呢？
为了获得单个离子通道的精确信息就需要提高记录的空间分辨率，即减小记录的面积。可是当时的玻璃电极不能与细胞膜完全贴合，由此产生了大量噪声；这就使得原本就是皮安级的（相当于一万亿分之一安培）单个离子通道产生的电流完全淹没在了噪音中，根本分辨不出来。
于是1976年德国的Erwin Neher和Bert Sakmann在改进前人工作的基础上，使用双电极电压钳技术，两根电极（BC）控制胞内电位，再用一个借由负反馈电阻的运算放大器对细胞外电极（A）内部进行钳位（使电位保持在特定数值），从而检测该电极下一小片细胞膜的单通道电流。也就是说，将玻璃微吸管充入含有乙酰胆碱类似物的电解质溶液，轻压在蛙的骨骼肌纤维表面，使得面积仅有十平方微米的细胞膜从电学上隔离，并记录到了只有皮安级的M型乙酰胆碱受体通道电流！后来，马普所的科学家不断完善技术，使得单通道的电流能够清晰的从噪声中分辨出来，细胞发音的密码由此被破解。后来膜片钳技术逐渐成熟，只需用一根直径小于2μm的玻璃微电极即可检测单个一小片膜或几乎整个细胞膜上的离子通道。
为了使小片的膜更好地被记录，进行膜片钳记录时，我们会先在显微镜下找到细胞，并向电极吹口气，一方面吹走路途中的障碍物，穿过组织中寻找到看中的它；另一方面在电极尖端抵到细胞表面时撤掉正压，细胞膜就会由于压强而吸引至玻璃电极内部。
如果想要更加了解胞内的情况，只需要再轻盈地Kiss一下——破膜——形成全细胞记录，便能够使得电极内部的物质进入神经元，深入了解它了。
膜片钳技术的发明，使得人们从功能层面更加清楚地认识了动作电位产生的电学元件——离子通道；离子通道广泛地存在不同细胞内发挥各种重要的功能，比如我们组在09发表负责动作电位去极化的钠离子通道，在动作电位的产生和传播过程中也负责着不同的功能：Na1.6位于轴突始段近端，阈值很低，负责动作电位的爆发；Na1.2位于轴突始段远端，阈值较高，负责动作电位向胞体和树突的回传；离子通道也是多种药物的靶点，尼莫地平、硝苯地平通过阻断钙离子通道来降低血压；离子通道的缺陷还会引起严重的疾病，如钾离子通道病变引起的癫痫。
由此，Neher 和Sakmann获得了1991年诺贝尔生理或医学奖。
作为先进的细胞电生理学技术，膜片钳是研究离子通道功能最重要的手段；并且随着技术的发展，自动膜片钳技术的出现在找细胞等步骤上实现了自动化。比如佐治亚理工学院（Georgia Tech）的 Precision Biosystems Lab就为@patcherbot建立了twitter，每记录一个细胞，就发一条推！
Sackmann和Neher两人通过膜片钳技术第一次从电生理角度证明了离子通道的存在；
而众多离子通道又是细胞产生动作电位的电学元件基础（详见 insoulter 诺奖膜片钳专题| 从RC电路到H-H模型）；
动作电位是神经元兴奋和活动的标志，也是神经信息编码、传导的基本单元（详见 ChenLee如何倾听神经元的“对话”）；
因此，Sackmann和Neher两人从这样一个巧妙地角度，发现了神经元“交流的密码”。
最后，感谢 ChenLee 在文章编辑过程中提出的宝贵建议。
参考资料
题图来自插画师网站Neurocomic。
Neuroscience: The great squid hunt
Hu W, Tian C, Li T, Yang M, Hou H, Shu Y. (2009) Distinct Contributions of Nav1.6 and Nav1.2 in Action Potential Initiation and Backpropagation. Nature Neuroscience. Doi:10.1038/nn.2359(News and Views: Who let the spikes out?)
Neher Erwin and Sakmann Bert.(1979) Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. doi:10.1038/260799a0
https://twitter.com/patcherbot
https://www.youtube.com/watch?v=xD5XvcNHiGo
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1991
Bert Sakmann - Biographical
关兵才，张海林，李之望.《细胞电生理学基本原理与膜片钳技术》.科学出版社.2013.
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