【人物与科研】香港科技大学唐本忠院士团队：从聚集诱导发光出发—银离子探针, 荧光银染及银离子释放动态的监测

导语

近年来，聚集诱导发光的研究与应用获得了蓬勃的发展。其中，“溶解不发光，聚集发光”，应用这一强烈的荧光性能转变已成为化学传感器领域中的一条成熟可靠的设计思路，由此发展出了一系列荧光探针，可以高灵敏度检测各种小分子（如CO2，单糖，腐败物排放的氨）、离子、生物大分子（如尿蛋白，心磷脂）以及微生物（如细菌，真菌，病毒，藻类）等。银离子检测具有重要应用前景，因为银离子对生物分子具有高选择亲和性，依此发展的银染技术是实验室中检测分析生物结构（包括蛋白，核酸，组织切片）的经典手段。此外，银材料是高效的抗菌材料，特别是纳米银材料，已广泛应用于生鲜食品包装，医疗器械抗污和废水处理中。银的杀菌功能被认为与其释放的银离子的浓度相关。定征银离子的释放过程能帮助解析/研讨银材料的真实杀菌机制与潜力，并对分析银材料的生物及环境毒性具有重大意义。近日，香港科技大学（HKUST）的唐本忠院士团队及其合作者在银离子检测及其相关的应用取得了新突破。

唐本忠院士课题组往期报道回顾：

唐本忠院士简介

香港科技大学唐本忠院士课题组照片（2017）

前沿成果：依聚集诱导发光原理设计的银离子检测体系及应用

理论与设计：AIE型银离子探针

近年以来，利用聚集诱导发光（AIE）现象设计的金属离子探针的报道并不少见。此系列工作中用经典的四苯乙烯作为AIE荧光生色核，同时利用Tetrazolate负离子作为引导银离子聚集的高亲和靶向基团。与其他银离子探针相比，该探针（TPE-4TA）的结构优势是能保有四个负电荷，故而在水相中能高度溶解。Tetrazolate负离子-银离子的特异沉淀反应在19世纪已被发现，上世纪50年代被大量研究，在近年的金属有机聚合物研究中少有提及，一般认为难溶结构为金属-有机分子通过配位连接的高分子聚合物。

图1. 聚集诱导发光型银离子探针的设计

（来源: Angew. Chem. Int. Ed., DOI: 10.1002/anie.201801653）

聚集发光检测过程的表征

如前所述，银离子识别是个AIE过程。AIE探针溶于水时处于暗态，不能受激发光；银离子加入后，能与AIE探针组装成纳米结构（图2 , c 与 d），并受375 nm光激发发出绿光（图2, a与b）。分析发现，该系统针对银离子检测限达到纳摩尔级别。此外，检测性能稳定性较高：1. 别的阳离子几乎无响应（图2, e）；2. pH 5~12环境中响应稳定（图2, f）。

图2. 聚集诱导发光银离子识别过程的表征

（来源: Angew. Chem. Int. Ed., DOI: 10.1002/anie.201801653）

应用一：荧光银染技术 – Silver-AIE蛋白染色

银染是实验室中凝胶电泳分离后进行蛋白/核酸等生物分子定征的经典方法，常用于一维与二维蛋白胶的分析鉴定（图3）。传统银染包含两个主要步骤：1. 银离子选择性地与生物分子结合；2. 在原位将银离子还原成深色的金属银纳米粒子，继而标示蛋白。因为还原银生色反应较难控制，实际使用过程中，银染面临着几个问题：重复性不高，不能定量蛋白含量，背景较强，常需用敏化剂（如戊二醛）及由此而导致后续的质谱分析失效。此文利用银离子特异的聚集诱导发光替代传统的银还原生色（银粒子产生）过程（图3），继而极大规避了传统银染的缺陷，这是一种新的银染手段。

图3. 传统银染示例（上部）, 原理（左下）及荧光银染方案（右下）

（来源: Angew. Chem. Int. Ed., DOI: 10.1002/anie.201801653）

借鉴传统的硝酸银染色，文中发展了Silver-AIE染色技术。参见下图4a，该项技术操作简单：在电泳分离并乙酸固定后，将胶先浸入AgNO3溶液。简单清洗后，再浸入AIE溶液。再次简单清洗后，即可在紫外灯下显示（图4b与图4c SYPRO Ruby染色结果对照）。

图4. Silver-AIE染色流程及效果

（来源: Angew. Chem. Int. Ed., DOI: 10.1002/anie.201801653）

作者用包含14种不同分子量的蛋白库，对比了该Silver-AIE染色与传统硝酸银染色以及常用SYPRO Ruby荧光染色，发现Silver-AIE染色在背景（图5a），检测下限（图5b），条带轮廓显示（图5c），全蛋白分子整体感应效能（图5d）以及蛋白定量分析（图5e）中都体现出优良性质。特别是作为一种银染技术，该Silver-AIE染色在非常宽浓度区间表现出线性性质（图5e），适用于一维胶定量分析和二维胶的定量/对比分析。

图5. 三种蛋白染色方法的比较研究

（来源: Angew. Chem. Int. Ed., DOI: 10.1002/anie.201801653）

应用二：银离子释放过程的监测

因具有出色的广谱杀菌性能，银材料特别是纳米银，已成为在医疗器械，食物生鲜包装以及污水废水处理中非常重要的一类抗菌杀菌材料。此外，作为重金属元素材料，银进入自然环境后也影响微生物生命体，带来环境毒性。银纳米材料中释放的银离子被认为是纳米银杀菌等生物效应的实际作用物质。因此，监测银离子释放的分析方法，在探讨和评估银材料杀菌，环境毒性等研究方面有重要意义。

银离子从银纳米材料的释放过程监测要求检测系统能区别1价银离子和0价金属银纳米粒子。目前，实验室常用的方法为元素分析定量（如ICP-MS，电感耦合等离子体质谱仪）超滤后的溶液银浓度。如需过程监测，这种方法操作繁复、成本高、不简便。在这部分，前文所述的TPE-4TA银离子探针可以方便地定量溶液中在任何时刻的银离子浓度（比如纳米线，图6左），结果与ICP-MS所得分析结果能互相印证（图6右）。此外，文中也验证了该AIE探针对银离子有剧烈响应，对银离子以及其他一系列无机纳米粒子都不响应或弱响应。

图6. 不同时间点银纳米线溶液中的银离子探针响应曲线（左）；对标校准曲线后显示的相应银子浓度时间动态
（黑色曲线：AIE荧光方法）及对照的经典ICP-MS方法（红色曲线）

（来源：Chem. Commun., DOI: 10.1039/C8CC02245C）

为了近一步验证新方法的有效性和监测敏感性，文中用不同表面保护及尺寸的银纳米颗粒作了对比测试。表1总结了AIE监测方法与ICP-MS方法的结果，证实了AIE方法在银离子的释放动态分析的有效性。从实际操作来看，基于荧光的AIE监测无需超滤分离，只需常见荧光分析设备，是一种简便和高效低成本的新方法。

表1. 用AIE及ICP-MS方法检测不同银纳米粒子的银离子释放动态的比较分析

（来源：Chem. Commun., DOI: 10.1039/C8CC02245C）

总结

从聚集诱导发光设计出发，研究者利用银离子-Tetrazolate负离子特异沉淀响应，设计了一类新的水溶性银离子荧光探针。利用该聚集发光过程，发展了适用于电泳凝胶分离后全蛋白组分分析的荧光银染技术，克服了传统银染的诸多缺点。此外，该探针能区别银离子与单质银，可被用作分析银离子从各种纳米材料中的释放动态过程，操作简单、高效且与经典ICP-MS方法得到的结果能相互印证。

应用于蛋白凝胶分析的荧光银染技术成果以“Fluorogenic Ag⁺–Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining”为题近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.上， 通讯作者为唐本忠院士和Karolinska Institutet刘鸣炜复修医学中心陈斯杰教授（论文作者：Sheng Xie, Alex Y. H. Wong, Ryan T. K. Kwok, Ying Li, Huifang Su, Jacky W. Y. Lam, Sijie Chen,* and Ben Zhong Tang*）。利用AIE探针检测银离子从纳米银材料中释放动态的成果以“Real-time monitoring of the dissolution kinetics of silver nanoparticles and nanowires in aquatic environments using an aggregation-induced emission fluorogen”为题近期发表在Chem. Commun.上，通讯作者为唐本忠院士和香港科技大学生物系王文雄教授（论文作者：Neng Yan, Sheng Xie, Ben Zhong Tang*, Wen-Xiong Wang*）。

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