【人物与科研】浙江大学苏彬教授课题组：电位分辨的多色电化学发光用于同一样本中多种肿瘤标志物的同时检测
导语
肿瘤标志物的精准检测对肿瘤早期诊断、分期、治疗策略、疗效评估和预后随访等各个方面均具有重要的价值。常规影像学检查在大多数肿瘤早期诊断中捉襟见肘。组织活检是一种侵入性检查方式，给患者造成痛苦，且存在取出样本量无法满足后续分析需求的问题；针对某些类型的肿瘤，该方法还面临无法取样的困境。细胞学检查结果假阴/阳性比例高，常常存在漏诊。目前已报道的生化传感器大多用于单一肿瘤标志物检测。然而，单一肿瘤标志物对于肿瘤检测的灵敏度和特异性偏低，寻找针对某一肿瘤具有100%特异性和敏感性的“理想”标志物又是十分困难的。为了提高临床诊断的准确性和可靠性以及预后评估的需求，临床上需要对肿瘤相关的多种标志物进行联检。
电化学发光免疫分析是最新一代的临床免疫检测技术，但传统强度依赖型的电化学发光免疫分析只能对肿瘤标志物进行逐一或平行分析，过程耗时且样本消耗量大。基于微孔板阵列的电化学发光成像免疫分析平台可同时实现多个肿瘤标志物的检测，但往往需要制备光电性能稳定的多抗体预包被微阵列电极板，工艺较为复杂。如何实现多种肿瘤标志物，尤其是与一种肿瘤相关的多种标志物的同时电化学发光检测具有重要意义，但颇具挑战，难点在于电化学发光探针信号的电位和波长可控调制和分辨。最近，浙江大学苏彬教授课题组基于前期发展的多模式电化学发光测量与成像平台，通过设计合成多种探针分子，建立了一个电位分辨的多色电化学发光体系，并将其成功用于同一样本中多种肿瘤标志物的同时识别和检测。相关成果发表于J. Am. Chem. Soc.（DOI: 10.1021/jacs.8b09422）。
苏彬教授课题组简介
苏彬教授课题组聚焦于电分析化学涉及的界面过程相关基础研究，致力于提高电化学测量的空间分辨性能和界面抗污染性能。目前开展的研究工作包括：发展光电化学测量和成像新方法与新技术，基于纳米孔（膜）的抗污染界面构建与复杂分析体系测量（如单细胞、活体神经化学物质分析）和发展指纹相关的痕迹检验方法与技术。
苏彬教授简介
苏彬，浙江大学化学系教授，分析化学研究所所长。1999年本科毕业于吉林大学化学系；2002年6月获得中科院长春应用化学研究所硕士学位；2006年4月获得瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）博士学位；2009年6月开始在EPFL从事博士后研究。2009年任浙江大学化学系特聘研究员（Tenure-Tracked Professor）和独立课题组负责人（Principal Investigator）。2013年1月起晋升浙江大学教授。主要从事界面电化学、光电化学测量与成像方法/技术、微纳尺度分子分离和分析、指纹识别与痕迹检验分析等方面的基础研究，在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., ACS Nano, Anal. Chem.等高水平期刊发表论文100余篇，获得国内发明专利授权9项。获得的主要奖励包括：2005年国家优秀自费留学生奖学金，2012年教育部新世纪优秀人才，2012年国家自然科学基金委优秀青年基金。
前沿科研成果
电位分辨的多色电化学发光用于
同一样本中多种肿瘤标志物的同时检测
作者以经典的电化学发光探针，三联吡啶钌(II)（Ru(bpy)32+, 5）和三(苯基吡啶)铱(III)（Ir(ppy)3, 2）为出发点，通过配体修饰等策略，合成了几种钌、铱金属配合物，分别为Ir(dFCF3ppy)2(dtbbpy)+（1），Ir(ppy)2(dtbbpy)+（3），Ir(ppy)2(dvbpy)+（4）和Ru(bpy)2(dvbpy)2+（6）（图1a）。这六种金属配合物的电化学发光波长迥异，几乎覆盖整个可见光区。最大发射波长依次为491 nm, 526 nm, 591 nm, 614 nm, 622 nm和636 nm（图1b）；探针1和2的电化学发光光谱最大峰位置仅相差35 nm，若同时采集，很难精确地区分两者的光谱信号。然而，它们的氧化还原电位分别位于1.75 V和0.74 V（vs SCE，下同，图1c），相差1.01 V，这使得通过调节电极电位选择性地激发同一混合溶液中单一发光体的电化学发光成为了可能。探针3-6的氧化还原电位均位于1.3 V左右，与探针1和2可相互区分。这四种探针分子的电化学发光波长均位于长波方向，特别是探针6与1和2的电化学发光最大波长分别相差145 nm和110 nm，有望通过光谱分辨混合体系中的电化学发光过程。因此，作者选择蓝光探针1、绿光探针2和红光探针6用于后续的电位、波长双分辨电化学发光体系的发光机制和多种肿瘤标志物同时检测的研究。
图1. （a）电化学发光探针分子结构式；（b）探针的电化学发光光谱；（c）循环伏安图
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
作者以三正丙胺（TPrA）作为共反应剂，从电化学发光强度、光谱、图像及热力学分析等多个角度研究了单一的红、绿、蓝三色探针及混合体系的电化学发光行为。电化学发光（ECL）强度-电位曲线（图2a, c, e）和spooling ECL光谱（图2b, d, f）测试结果均表明，一旦扫描电位达到发光起始电位后，红光探针（6）和蓝光探针（1）的电化学发光强度随扫描电位的增加而增加；而绿光探针（2）的电化学发光行为则出现了反常，在较低电位区（<1 V），它的电化学发光强度随着氧化电位的增加而增加，当电位超过1 V后，其发光强度显著降低，发生明显的淬灭，即表现为电化学发光“开-关”效应。
图2. 红光、蓝光和绿光探针的电化学发光强度-电位曲线（a, c, e）和spooling ECL光谱（b, d, f）：探针6（a, b），1（c, d）和2（e, f）
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
为了研究这一反常现象，作者采用电化学质谱联用技术原位追踪和实时检测电化学发光反应中的关键中间体。图3a所示为电化学质谱联用装置示意图。图3b为在1.0 V电位下，反应体系中有无TPrA时的质谱对比图。当体系中不加入TPrA时（图3b上），除内标THA+（m/z 354）的信号外，仅捕获到了电化学氧化生成的Ir(ppy)3+的信号（m/z 655）。当体系中加入TPrA后（图3b下），与TPrA相关的离子中间体如TPrAH+（m/z 144）、TPrA+•（m/z 142）、PrN=CH2+（m/z 114）和HNPr2+（m/z 102）被成功检出，而Ir(ppy)3+的信号几乎观察不到。这是由于在该电位下，电化学氧化产生的Ir(ppy)3+与TPrA•通过电子转移反应形成Ir(ppy)3*，因此，检测不到Ir(ppy)3+的信号。这也说明，电化学发光强度越高，Ir(ppy)3+的含量越低，质谱峰信号也越弱。作者考察了不同电位下，Ir(ppy)3+的相对含量的变化曲线（图3c，绿线表示体系中含有TPrA，黑线表示不含有TPrA）。在较高电位下（1.3 V及以上），Ir(ppy)3+的质谱峰强度达到最大，而在该电位下其电化学发光强度最低。由此证明探针2在高电位下的电化学发光淬灭是由于激发态物种Ir(ppy)3*与TPrA+•发生化学反应造成的（eq 1），这一淬灭机制使混合体系下多色电化学发光的电位调控成为了可能。
图3. 电化学质谱联用技术用于电化学发光反应中间体的原位追踪及实时检测
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
作者以宫颈癌检测为模型，癌胚抗原（CEA）作为首选指标，甲胎蛋白（AFP）和人绒毛膜促性腺激素β亚单元（β-HCG）作为辅助指标，考察了电位分辨的多色电化学发光在多种肿瘤标志物同时检测中的应用。作者将红、绿、蓝三种探针分子溶于乙腈或四氢呋喃等有机溶剂，通过溶胀聚苯乙烯微球（PSB）可将探针分子包埋到其中，制备探针、抗体双重标记的聚苯乙烯微球。
图4.（a）同一样本多种肿瘤标志物免疫分析流程图；（b）电位分辨的多色电化学发光用于多种标志物同时检测示意图
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
多指标同时检测的免疫分析流程主要包括孵育、免疫磁分离、洗涤、检测等步骤（图4a）。免疫磁微球表面修饰的捕获抗体能够特异性地结合抗原目标物，进而与标记有检测抗体的探针掺杂PSB形成免疫夹心复合物。作者利用磁分离技术，将免疫复合物从反应体系中分离出来；进一步在体系中加入适量的乙腈，溶胀PSB以释放探针分子。接着，作者将电位分辨的多色电化学发光法用于多种标志物的同时检测（图4b）。通过施加不同的氧化电位，作者利用光谱仪记录不同电位下得到的电化学发光光谱，并对发光电位和波长进行归类（图5）。氧化电位为0.74 V时，作者观察到发光波长位于520 nm的信号峰，其对应于CEA的检出；氧化电位分别为1.33 V和1.75 V时，作者观察到了640 nm和500 nm的信号峰，其对应于AFP和β-HCG的检出。
图5. CEA、AFP和β-HCG多指标同时检测
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
电位分辨的多色电化学发光用于多种标志物的同时检测，既可在同一样本中一次性完成多个指标的检测，又无需对捕获抗体进行空间定位点样。并且，只需用探针、抗体双重编码微球替换商业化电化学发光免疫分析试剂盒中的探针标记抗体，即可实现与试剂盒的兼容。因此，该平台也适用于其他生物标志物的同时检测。虽然目前定量检测结果有限，但该工作验证了同时识别病理浓度值范围的几种生物标志物的可行性，尤其适用于针对某一特定疾病的定性筛查及免疫检测试剂盒的开发。设计、合成新型的电化学发光体并严格控制多组分免疫分析过程，就能实现多种生物标志物的同时定量检测。当然，这一多组分同时检测方法也存在一些不足和有待改进的地方：例如，电化学发光体的选择范围受限。目前报道的具有电位或波长分辨能力的且发光效率高的电化学发光体大多为疏水性钌、铱金属配合物，而且，这类探针缺少适当的生化标记位点，不得不先将其负载到聚合物微球中再溶胀释放，这也可能造成检测结果重复性降低。因此，合成具有电位或波长分辨能力且具有生化标记位点的、水溶性电化学发光体尤为迫切。
该研究成果近期发表于J. Am. Chem. Soc.（DOI: 10.1021/jacs.8b09422），论文通讯作者为浙江大学化学系苏彬教授，第一作者为苏彬教授课题组郭维亮博士。该工作得到了北京大学邵元华教授在质谱分析方面的指导、浙江大学生命科学学院朱成钢副教授和杭州Genesea生物技术有限公司在免疫检测方面的支持，以及国家自然科学基金、浙江省自然科学基金的资助。
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