【材料】JACS：机械敏感型荧光探针用于细胞器膜张力的成像

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细胞内力在生物过程中起着重要的作用，细胞内力的检测和分析对于理解生物细胞内膜动力学具有重要的意义。其中，等离子膜张力会伴随不同生物化学过程而发生改变，因此引起了研究者的广泛关注。一直以来，检测细胞内力具有极大的挑战性，然而，定量显微技术的不断发展使得用于检测细胞内力的荧光探针的开发成为一种可能。

日前，瑞士日内瓦大学Aurélien Roux副教授以及Stefan Matile教授基于膜张力的变化会改变探针荧光寿命这一研究思路，设计合成了一系列鳍状荧光探针，用于有选择性地标记细胞溶酶体、内质网以及线粒体等细胞器。

基于两个相连的二噻吩并噻吩（DTT）以及一些特殊响应细胞器的基团，作者构建了系列推拉型荧光探针。在探针结构中，两个DTT的扭曲结构可以通过甲基间的斥力以及内环硫之间δ空穴的调节扭转为共平面结构，从而最大发射波长发生红移，荧光寿命增长。作者在DTT桥两端连接一个氧醚电子供体以及一个氰基电子受体，担任推拉型探针的组件。相关成果发表于J. Am. Chem. Soc.（DOI:10.1021/jacs.8b13189）。

作者首先合成了鳍状探针1，由于羧酸基团可靶向特定细胞膜，作者将探针1用于等离子细胞膜的检测。随后，作者构建了探针2-5，并将其分别用于标记细胞膜、溶酶体、内质网以及线粒体（Figure 1A）。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

随后，作者以首端为羧酸的鳍状探针1为例，对探针的作用机制进行了探究（Figure 1B）。作者发现，在细胞膜上由于可拉伸与不可拉伸的脂质相之间膜张力的增加，膜上形成有序的微小区域，机械敏感的探针1标记细胞膜后，探针结构通过基态平面化响应增加的膜序列，将结果转化为最大发射波长的增加以及荧光寿命增强这些可记录的数据，从而达到细胞膜标记的可视化。相比于以往用于检测黏度和极性的探针，探针1的这一特性是极其罕见的。最后，作者将探针1-5的相关数据进行了整理（Table 1）。作者发现，区别于探针2-4，亲水性的探针5对线粒体膜张力并未作出响应，作者推测这一结果可能是探针5主要聚集在线粒体内腔所致。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了更加直观地展现探针1-4对细胞器的标记作用，作者对HeLa Kyoto细胞以及COS7细胞等活细胞染色并进行共聚焦成像以及荧光寿命分析。作者发现探针2-4存在最大激发波长红移的现象（Figure 2A）。随后，作者通过单膜小泡体系，用探针4进行染色，通过荧光寿命成像显微镜技术（FLIM）验证了有序细胞膜的荧光寿命更长，这与探针的设计理念相一致（Figure 2B）。作者通过在HeLa Kyoto细胞内对探针2-4进行共定位试验，验证了探针2-4可准确地定位于相应的细胞器膜上（Figure 2D-2F）。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者进一步对探针2-4标记过的HeLa Kyoto细胞以及COS7细胞进行FLIM成像，由于COS7细胞的成像图更为清晰，作者以这种细胞系为例进行分析（Figure 3）。作者研究发现，探针2-4可以清晰地定位于特定的细胞器膜，这与先前的共聚焦实验结果相一致。同时，由于细胞核膜以及细胞核周围的内质网比较致密，作者可以在FLIM成像图上清晰地看到内质网（Figure 3B）。有趣的是，作者发现，在细胞器静止状态下，探针2-4的荧光寿命与膜张力没有直接的关联；但是当渗透压冲击导致膜张力减小时，探针的荧光寿命缩短（Figure 2G 和 Figure 3中的红色图线）。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者进行了超出探针表征范围的选定实验，来验证探针在促进新领域开发方面的潜力。作者以溶酶体探针2为例，通过与荧光标记的表皮生长因子（EGF）进行共定位来探究内涵体运输过程。作者发现荧光标记的EGF主要定位于后期的内涵体以及溶酶体中，并与探针2的荧光相重合，这一结果说明通过更换探针2中的吗啉基团，可以实现细胞内较弱酸性细胞器的检测，如早期内涵体（Figure 4A）。除上述例子外，作者还通过探针3和探针4的共定位实验以及荧光寿命和强度分析，发现线粒体信号越强，张力探针在管状内质网处的荧光寿命越长（Figure 4B）。同时，作者也通过探针4标记了的COS7细胞，发现裂变收缩的线粒体区域由于探针浓度降低，荧光强度降低，但荧光寿命延长，这一发现为线粒体收缩期间膜张力的增加提供了直接证据（Figure 4C）。

（来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结：本文作者设计合成了一系列响应膜张力的机械敏感探针1-5，并将探针2-4用于活细胞细胞器的标记。为了最大化表现探针的应用潜力，作者还将探针2-4分别应用于内涵体的标记、线粒体收缩期间膜张力变化的探究等方面，从而为在细胞水平层面研究细胞内生物变化及过程提供了新的思路。

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