【生化】Angew：“取长补短”——用于Aβ斑块双光子成像的分子设计及应用

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阿尔兹海默症（AD）是一种神经退行性疾病，其发病率逐年升高，并在老年人中表现出较高的致死率。阿尔兹海默症的主要病理特征是老年斑和神经元纤维缠结，其中老年斑是Aβ蛋白沉淀造成。因此，开发有效的方法揭示AD的病理过程，并可视化Aβ蛋白在临床诊疗方面显得尤为迫切。

近日，韩国高丽大学的Jong Seung Kim教授、首尔国立大学的Inhee Mook-Jung教授及庆熙大学的Dokyoung Kim教授合作，设计合成了一种新的荧光团IRI-1（分子内可旋转的亚氨基香豆素1），其具有良好的双光子截面、较弱的背景荧光，且能进行体内双光子（TP）成像。相关成果以“Harnessing Intramolecular Rotation to Enhance Two-photon Imaging of Aβ Plaques Through Minimizing Background Fluorescence”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201900549）。

首先，作者探究了2种已报道的能选择性聚集于Aβ蛋白的染料（IBC 2和ThT）的优良特性。基于分子转子原理，ThT存在有效的去激发途径，与靶蛋白结合后荧光强度显著增强，大大提高了信噪比；IBC 2具有较大的双光子截面，且能穿透血脑屏障。基于IBC 2和ThT的优良特性，作者结合两者设计了亲脂性的中性分子IRI-1（Scheme 1）。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接着，作者测定了IRI-1的吸收和发射光谱。在Aβ原纤维存在时，IRI-1在419 nm出存在一个强的吸收峰（Figure 1A）。当向IRI-1的PBS溶液中加入Aβ原纤维时，566 nm处的荧光强度迅速增强167倍（ThT仅增强20倍），证明了分子转子的引入减少了荧光脱靶的发生（Figure 1B）。幸运的是，潜在的干扰物（如金属离子、氨基酸和硫醇）对IRI-1的荧光均没有产生明显的影响（Figure 1C）。另外，非线性拟合结果表明IRI-1对Aβ原纤维的结合亲和力为K_d=374±115 nM（Figure 1D）。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

随后，作者通过理论计算探究探针的溶剂依赖性激发态行为和溶剂变色现象（Figure 2）。计算结果表明，极性溶剂中IRI-1的非发射性去激发主要是因为扭曲的分子内电荷转移（TICT），同时在较低极性溶剂中存在局部激发态发光的现象，这与实验结果相一致。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者选择已报道的Aβ_1-42分子的近原子分辨率结构作为蛋白支架进行对接模拟。对接结果表明，IRI-1存在两个具有相似结合亲和力的相互作用区域。第一个结合位点位于沿着原纤维轴的隧道中，由Phe¹⁹、Asn²⁷、Gly²⁹和Ile³¹的侧链组成，而第二个结合位点位于沿着原纤维轴的凹槽上（Figure 3）。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

最后，作者将AD模型小鼠的脑组织切片与IRI-1/IBC 2共同孵育，发现用IRI-1处理的样品的背景荧光明显比用IBC 2处理的弱（Figure 4A 和4B）。同样的，半定量分析单个Aβ斑块的荧光强度也证实了该观点（Figure 4C）。共同孵育2小时后，与IBC 2处理组相比，IRI-1处理的脑切片的信号背景比增加约3.75倍（Figure 4D），这说明TICT机制对于提高信噪比具有重要的作用。

在确认IRI-1可标记Aβ斑块并抑制背景荧光后，作者通过腹腔注射研究IRI-1在体内的作用。同时将IRI-1与传统的特异性靶向Aβ斑块的双光子荧光染料MeO-X04共同给药，作者清晰地发现MeO-X04和IRI-1的荧光信号完美地重叠（Figure 4E-4J）。另外，除了额叶皮质中的Aβ斑块外，IRI-1还可以用于染色脑淀粉样血管病（CAA）相关的脑血管上的Aβ沉积物（Figure 4H-4J）。最后，3D双光子成像显示，在920 nm光的激发下，IRI-1可以检测深度达172 μm的Aβ斑块（Figure 4K ）。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

总而言之，作者将分子转子概念应用于检测Aβ斑块的染料设计中，合成了化合物IRI-1，其具有较低的背景荧光、较好的血脑屏障通透性以及对Aβ斑块的高选择性和灵敏性。因此，IRI-1有望在神经退行性领域（如AD的早期诊断和治疗）得到较好的应用。