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【药化】Nano Letter:纳米颗粒表面抗体的方向显著影响其靶向效率

nanobing CBG资讯 2022-06-22
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利用靶向蛋白将纳米药物递送到特殊的器官或者细胞可以显著提高药物的递送效率,但是蛋白质三维结构和生物学功能之间存在紧密联系,蛋白之间的相互识别不仅需要其维持正确的三维结构,还需要蛋白的方向正确,这使得蛋白的键合成为一个挑战。此前的研究已经发现纳米颗粒的位阻效应会阻碍蛋白的结合,而通过氨基键合抗体的传统方法导致大部分蛋白的方向都不适合其识别靶蛋白,而近年兴起的以应变促进叠氮-炔基环加成反应(strain-promoted alkyne−azide cycloaddition,SPAAC)为代表的点击反应由于具有反应速度快、效率高、反应条件温和、副反应少等优点,使得蛋白的键合变得更加简单方便。这种方法通常需要将炔基或者叠氮分子先键合在蛋白上,此前研究多使用琥珀酰亚胺酯(NHS酯)将这些小分子键合在蛋白质的赖氨酸的氨基上,这种方法难以控制,因为很难确定小分子键合的位置,这可能影响蛋白质的功能。


为了研究蛋白质键合方向对纳米颗粒靶向效率的影响,来自澳大利亚莫纳什大学的Angus P. R.Johnston教授带领他的研究小组通过一种遗传学方法将对叠氮苯丙氨酸(p-azidophenylalanine,azPhe)准确地修饰在蛋白质的某些位点,然后通过点击反应将之键合在量子点表面,在细胞水平研究了蛋白质键合方向对蛋白质结合靶细胞效率的影响,相关研究成果于近日发表在Nano Letter上,题为“Pointing in the Right Direction: Controlling the Orientation of Proteins on Nanoparticles Improves Targeting Efficiency”(DOI: 10.1021/acs.nanolett.8b04916)。


(图片来源:Nano Letter


作者选择了一种可以识别表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR,多种癌细胞都高表达该受体)的单域抗体(single domain antibody,sdAb,又称纳米抗体,仅含有一个重链可变区结构域)7D12 sdAb。作者选择了该蛋白质上的Gln13、Gly42、Asp73以及碳端作为键合量子点的位点,通过遗传学手段把相应位点突变成azPhe(Scheme 1),同时利用传统的NHS酯将叠氮基团随机键合在未修饰的蛋白质的氨基上作为对照。作者利用修饰过的细菌表达了这些蛋白质并对之进行纯化和检测,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸-飞行时间质谱确认了蛋白质的结构和纯度,并利用DBCO-Cy5与之反应确认了azPhe确实成功插入抗体。为了确定azPhe的插入是否影响sdAb的结合效率,作者利用荧光标记的sdAb去高表达EGFR的A549细胞共同孵育,然后通过流式细胞术对细胞进行了分析。结果显示,azPhe的插入并不影响抗体的结合效率,且与商用的靶向EGFR的西妥昔单抗效率相当(Figure 1)。


(图片来源:Nano Letter


为了确定sdAb在纳米颗粒表面的方向对其靶向效率的影响,作者将这些sdAbs结合在了15 nm的荧光量子点(Qdots)表面。结果显示,所有突变的sdAbs都可以对Qdots进行相似程度的修饰,每个Qdots上键合的抗体数量无显著差别。通过与高表达EGFR的A549细胞共同孵育,然后进行流式细胞术检测,作者发现这些量子点结合细胞的能力存在显著的差异:其中突变位点为Gln13的抗体修饰的Qdots结合细胞的能力最强,是NHS组的6倍,C端突变的抗体修饰的Qdots结合细胞的能力是NHS组的2.4倍,而突变位点为Gly42、Asp73的抗体修饰则基本不会增强Qdots结合细胞的能力(Figure 2)。


(图片来源:Nano Letter


为了进一步验证突变位点为Gln13的抗体修饰的Qdots结合细胞的能力,作者对孵育后的A549细胞进行了共聚焦观察,结果显示,确实有更多的突变位点为Gln13的抗体修饰的Qdots结合在细胞表面(Figure 3)。这些数据表明纳米颗粒表面抗体的方向确实会影响纳米颗粒结合细胞效率,而通过调控抗体的键合方向可以增强纳米颗粒结合靶细胞的能力


(图片来源:Nano Letter


综上,这项研究通过遗传学手段将叠氮化氨基酸嵌入sdAb的特殊位点,其可以控制抗体键合在纳米颗粒上的方向,这种方法比传统的随机键合的方法更精准有效。通过与细胞的共同孵育和表征,作者发现抗体键合的方向确实会显著影响纳米颗粒结合靶细胞的能力。因此在任何纳米颗粒表面键合抗体时可能都需要注意抗体的键合方向,一方面防止不恰当的键合方向导致抗体无法结合靶蛋白,另一方面可以通过优化抗体的键合方向来进一步优化纳米颗粒的靶向效率


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