【分析】Angew：生物催化剂变废为宝！卤代/硝基酚类污染物的简便快速检测！

城市和工业的不断发展，需要越来越多的化学物质，随之而来的则是日益增多的化学污染物。其中卤代酚类（halogenated phenols，HPs）和硝基酚类化合物（nitrophenols，NPs）在家庭和工业生产中广泛应用，而这两类化合物的泄露和农药、除草剂的降解导致它们在环境中不断富集，这被认为会对自然环境和人类健康带来极大的危害。生物催化剂作为一种强有力、可持续且经济实惠的催化剂，或许是化解这些污染危机的有效解决手段。

基于此，泰国Vidyasirimedhi科学技术研究所的Pimchai Chaiyen课题组开发了一种基于黄素依赖的单加氧酶（Flavin-dependent monooxygenase，HadA）的生物催化体系（Figure 1），可以将HPs和NPs转化为苯醌（benzoquinone，BQ），而苯醌可以和D-半胱氨酸（D-cysteine，D-Cys）反应生成D-萤光素（D-luciferin），后者可以作为萤光素酶的底物发出萤光，实现相关污染物的快速简便定量/性检测，相关研究成果发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201904923）。

作者首先检查了HadA催化一系列苯酚衍生物（4-硝基苯酚（4-NP）、4-氟苯酚（4-FP）、4-氯苯酚（4-CP）、4-溴苯酚（4-BrP）和4-碘酚（4-IP））生成BQ的效率，结果发现HadA可以在3个小时内将所有原料全部转化为BQ（转化率100%）。当反应液中存在D-Cys时，作者用质谱和核磁氢谱证明可以生成D-萤光素。当作者往反应液中加入萤光素酶后，溶液会发出黄绿色的光，其生物发光的峰值在560nm左右，由于L-萤光素不是萤光素酶的底物，因此证明了生成的产物确实为D-萤光素。作者还用质谱检测到了D-萤光素合成的中间产物（Figure 2，table 1）。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

为了提高D-萤光素的产率，作者对反应体系进行了一系列优化（Table 1）：1）调整反应体系浓度：结果显示最佳浓度为D-Cys：4-NP=10/1，当NAD⁺、FAD、HadA的浓度依次为10、4、50 μM时，产率可达4.6%。2）增加BQ的稳定性：加入过氧化氢酶或超氧化物歧化酶等ROS清除剂可以清除反应产生的过氧化氢，从而增加BQ稳定性，此时最高的产率可达15.8%。3）调节溶液pH：在pH等于8的时候产率可达21%，是传统BQ与D-Cys缩合反应产率的70倍。同时作者还研究了加入其他试剂对生物法发光信号的影响，最终发现加入0.05 mM 辅酶A、4 mM DTT、0.5%（v/v）甘油、62 μM EDTA后可以使荧光信号增加2倍。作者还发现生物发光的信号在ppb的浓度范围内与浓度成线性相关，这刚好是美国环境保护署等部门要求检测的范围，因此这种方法可以用于检测环境和食物中的4-NP/HPs。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

由于NP、HP是硝基酚类化合物和卤代酚类化合物在体内的主要代谢物，因此常作为尿液和血液中的生物标记物来检测接触这些物质的健康风险，但是传统依赖质谱的方法都需要预先纯化以及高超的操作技术，这在一定程度上阻碍了对这些化合物的及时检测。为此，作者尝试了他们开发的方法是否可以用生物发光来检测相关物质（Figure 2, Table 1）。作者在血液和合成尿液样品中加入了4-NP和4-CP来模拟含有这些物质的样品，然后用他们开发的方法进行检测。结果发现他们开发的方法的检测极限和定量极限如下：4-NP和4-CP的定量极限分别为0.1和0.4 ppb，4-NP和4-CP的检测极限分别为0.04和0.1 ppb。因此这种方法的检测能力符合美国环境保护署等部门的检测要求，同时这种方法还不需要对样品进行任何纯化处理。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

总结，作者开发了一种化学-酶偶联反应体系，可以将4-NPs及4-HPs转化为BQ，最终合成D-萤光素。作者通过一系列条件筛选出了最佳的反应条件，可以高效率地合成D-萤光素，同时可以在萤光素酶的作用下产生萤光。基于这种方法，作者可以直接对生物样品中的相关物质进行定性和定量的检测，无需对样品进行纯化，也无需高超的操作技巧。因此这是一种使用方便、价格低廉的化学污染物检测方法，可以用于防止食品和消费品污染。