NGS基础 - FASTQ格式解释和质量评估
FASTQ文件格式和命名
高通量测序之后用于下游分析的数据一般存储在FASTQ文件中。为了节省空间，又不影响下游使用，也一般用gzip压缩的格式。
单端测序每个文库只返回一个FASTQ文件，双端测序两个FASTQ文件，左端一般命名为_1或R1，右端命名为_2或R2。
假如样品名字为ehbio，双端测序三个重复。习惯命名为ehbio_1_1.fq.gz ehbio_1_2.fq.gz, ehbio_2_1.fq.gz ehbio_2_2.fq.gz, ehbio_3_1.fq.gz ehbio_3_2.fq.gz. （第一个下划线后面的数字为重复，第二个下划线后面的数字指定哪一端）
FASTQ文件内容如下图所示：@开头，后面是reads的ID以及其他信息。
第二行为read的序列。
第三行以+开头，一般后面没有内容；若有则为序列的名字，与第一行相同。
第四行代表reads的质量值。质量值的计算方式为 (e是错误率，estimated probability of the base call being wrong)。如果该碱基测序出错的概率(e)为0.001，则Q应该为30。现在测序数据多采用Phred33编码，那么30+33=63，那么63对应的ASCii码为?，则在第四行中该碱基对应的质量代表值即为?。一般地，碱基质量从0-40, 即ASCii码为从 !(0+33)到I(40+33)。
+ FASTQ文件一般比较大，传输过程中可能会出现不完整情况，一般都会附带一个MD5校验值文件用于判断文件的完整性。如果文件内容不变，则MD5值不变，与是否压缩无关。# 获取MD5值
ct@ehbio:~/$ md5sum test.fq.gz | tee >MD5.txt
+ d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e test.fq.gz
# 验证MD5值
ct@ehbio:~/$ md5sum -c MD5.txt
test.fq.gz: 确定测序量评估
测序量可以从两个水平评估：测序reads数和测序碱基数。
ct@ehbio:~/ $ zcat test.fq.gz
@ehbio1
ACCGAGCTTTTTTTTTTTTTT
+
?????????????????????
@ehbio2
ACCGAGCTTTTTTTTTTTTTT
+
?????????????????????
@ehbio3
ACCGAGCTTTTTTTTTTTTTT
+
?????????????????????
# 获取行数，然后除以4，得到reads数
ct@ehbio:~/ $ echo $(( `zcat test.fq.gz | wc -l` / 4 ))
4
# 获取碱基数
ct@ehbio:~/ $ zcat test.fq.gz | grep -A 1 '^@' | grep '^[ACGTN]' | wc -c
66获得reads数和碱基数后，可以用表格展示。但为了更直观一般用柱状图展示。样品特别多时用直方图展示，优先关注是否存在测序量异常高或低的样品。
- 后续会推出柱状图和直方图一步绘图法测序质量
FASTQ文件的测序质量评估一般用FastQC软件来实现。这是一个基于Java的软件包，下载下来放到环境变量即可使用。
运行方式也很简单： fastqc ehbio_1_1.fq.gz ehbio_1_2.fq.gz
其生成结果和解释如下表所示
当样品数目很多时，会得到更多的质量评估图，结果很不直观。因此可以用下面所示的所有样品测序质量的散点图来表示。通过GC含量(横坐标)和碱基测序质量(纵坐标)来判断样品的测序质量。
+ 两个值都是FAIL的样品，需要重点关注。