还能这么玩儿？跟大牛解锁自噬检测

在《Hello~自噬》一文中，我们曾给大家介绍过自噬。自噬在维持稳态和多种疾病中都起着重要作用。那么在实验中，如何检测自噬呢？

自噬，简单来说就是细胞自己吃自己、废物再利用。细胞陷于困境时 (如营养物质匮乏)，启动自噬程序自救，通过降解蛋白质和细胞器获得必需的氨基酸、脂肪酸等营养物质维持基本生命活动，以便死中求生。一直以来，自噬都是生命科学领域的研究热点。
2020 年 8 月 17 日，图卢兹大学综合生物研究中心 Arnaud Besson 教授团队，在期刊 Nature cell biology 中发表的自噬相关文章 (图 1)，阐明了自噬与细胞周期调控的新机制。
图 1. p27 调控自噬-溶酶体途径，协调细胞周期和生长



背景介绍


p27^Kip1 (p27) 被认为是细胞周期蛋白 CDK 的抑制因子，具有诱导细胞周期停滞的能力。营养匮乏往往是自噬发生的主要诱导原因，已有研究表明，细胞质中的 p27 是自噬的正调节剂 (葡萄糖匮乏或者血清剥夺的条件下)，它可以保护细胞免受应激诱导的细胞凋亡。但是，p27 调控自噬作用的具体分子机制仍然是未知的。
接下来，M 君和大家一起来看看，关于自噬调控，作者团队做了哪些精彩的工作。



p27 调控细胞自噬

作者团队通过研究 p27^+/+ MEFs 和 p27^-/- MEFs 应对氨基酸剥夺后自噬的变化，证明了氨基酸缺乏的细胞中，p27 促进自噬。

细胞：

p27^+/+ MEFs: p27 野生型 (p27^+/+) 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs)，源于 p27 野生型小鼠胚胎。

p27^+/+ MEFs: p27 缺失型 (p27^-/-) MEFs，源于 p27 缺失的小鼠胚胎。
1、p27 促进自噬发生
LC3B-II 是自噬小体的标记物，位于自噬体膜，与溶酶体融合时被降解。氨基酸剥夺的短时间内，如图 2a 所示，p27^+/+ 和 p27^-/- 小鼠胚胎成纤维细胞中，LC3B-II 表达水平相似，随着氨基酸剥夺时间的延长，p27^-/- 中的 LC3B-II 表达水平明显会更高，并且在 48 小时表现出显著统计学差异 (图 2b)。在随后的实验中，选择 48 小时作为氨基酸的长时间剥夺的诱导时间。图 2c 的 LC3B 的免疫荧光染色同样也呼应这一观察结果 (红色箭头)。这表明 p27 可促进氨基酸剥夺细胞中的自噬。
图 2. 氨基酸剥夺不同时间，细胞中 LC3B，LC3B-I 和 LC3B-II 的表达【a-b: 指定时间段内氨基酸缺失的 p27^+/+和 p27^-/-MEFs 的 LC3B-I 和 LC3B-II 的表达和定量分析；c-d: p27^+/+ 和 p27^-/- MEFs 在 0 h 和氨基酸剥夺 48 h 后 LC3B（绿色荧光）免疫荧光染色和定量分析】

2、p27 调控自噬流的检测

自噬是一个多步骤的动态过程，当应答营养匮乏的压力时 (如氨基酸或葡萄糖缺乏)，细胞接受自噬诱导信号，随后会在胞浆处形成一种扁平的叫做吞噬泡 (Phagophore) 的双层膜结构。紧接着，吞噬泡不断延伸，包裹一些细胞元件或者自噬物 (Autophagic cargo)，形成密闭的球状的自噬小体 (Autophagosome)。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体 (Autolysosome)，自噬体中的内容物被溶酶体中的酶降解，降解产生的营养物质会被细胞重新利用。

在整个过程中，细胞将自噬物吞噬到自噬小体，直到最后自噬溶酶体形成并降解自噬物的这个过程被称为自噬流 (Autophagic flux) (图 3)。自噬流中的任一环节出现障碍自噬都无法完成其生物学功能。

图 3. 细胞应答营养匮乏压力时，自噬发生的示意图^[2]
【吞噬泡 (Phagophore)-自噬小体 (Autophagosome)-自噬溶酶体 (Autolysosome)】
上文已经说到 LC3B-II 通常是自噬小体的 Marker，哺乳动物细胞内 LC3B 的总量通常不会有巨大波动，一般只会出现 LC3B-I 和 LC3B-II 间的相互转换。

如果 LC3B-II 表达增加，可能是由于前期自噬活化后自噬小体增多导致的，也可能是后期自噬溶酶体清除失败使其积累所致。因此，某单一时间点的 LC3B-II 的表达改变并不能体现自噬流的改变。

在文章中，使用了 WB 检测蛋白、免疫荧光，mCherry-eGFP-LC3B 双荧光系统的组合测量方法，检测 p27^+/+ 和 p27^-/- MEFs 自噬流。

(1) 氯喹 (Chloroquine，CQ) 处理，检测自噬流中 LC3B-II 变化
在酸性溶酶体中，氯喹会使溶酶体 pH 值升高，使溶酶体中酸性水解酶失活 ，从而抑制细胞内自噬溶酶体的融合与降解。氯喹处理细胞会导致 LC3B-II 的聚集，此时观察到的 LC3B-II 的变化仅代表自噬小体数量的改变。

氯喹处理细胞后，在短期氨基酸剥夺的条件下 (0-4 h)，两种细胞的自噬通量是相似的 (图 4a, b)。但是随着时间的增加，长时间的氨基酸剥夺处理后，p27^-/- MEFs 与 p27^+/+ MEFs 相比，LC3B-II 数量显著降低 (图 4c, d)。这说明 p27 促进氨基酸缺失细胞中自噬通量。

图 4. 氯喹影响细胞 LC3B-II 的表达

【a-b: p27^+/+ 和 p27^-/- MEFs 中，aa-剥夺 0 h、1 h、4 h 后 (有或无氯喹处理) , LC3B-II 的表达和不同细胞中自噬流变化的定量分析 (LC3B-II+CQ/actin)/(LC3B-II-CQ/actin)；c-d: aa-剥夺 0 h、48 h 后，LC3B-II 的表达和自噬流变化的定量分析】

(2) p62/SQSTM1 在细胞中的积累

p62 也称为 SQSTM1 蛋白，作为一种调节因子参与自噬体的构成，具有底物的特异性，是连接 LC3B-II 与待降解泛素化底物的桥梁。p62 结合泛素化蛋白进入到自噬体后最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而得到清除 (图 5a)。自噬流被抑制时，p62/SQSTM1 会在自噬流受损的细胞中积累, 在细胞内整体 p62 水平的表达与自噬活性存在负相关。

如图 5 b 所示，随着时间的增长，p62 在氨基酸缺乏的 p27^-/- 细胞中的表达量更高，p27^-/- 细胞的自噬流受损，这进一步说明了，p27 可以促进自噬流活化。

图 5. p62 在自噬流受损的细胞中积累
【a: p62 参与自噬体的构成[3]；b: aa-剥夺 0 h 或 48 h，p62 和 Vinculin (Loading control) WB 结果；c: p62 归一化的定量分析。】

(3) mCherry-eGFP-LC3B 双荧光系统检测自噬体与自噬溶酶体。

mCherry (红光)-eGFP (绿光)-LC3B 串联荧光蛋白可用于检测自噬流水平的融合蛋白。它利用了酸性自溶酶体和中性自噬体之间的 pH 差异以及不同荧光素对 pH 的敏感性差异，以监控从自噬体到自溶酶体的进程 (图 6a)。

图 6. 串联荧光探针及荧光共定位检测自噬流

【a: mCherry-eGFP-LC3B 串联荧光探针示意图与机制^[6]；b: p27^+/+ 和p27^-/- MEFs 中，0 h 或 aa-剥夺 48 h 时，mCherry-eGFP-LC3B 示踪自噬体以及与自噬溶酶体形成；c: 自噬小体 (黄色) 和自噬溶酶体 (红色) 的定量分析】

如图 6a-b，mCherry 荧光基团的 pH 值稳定性比 GFP 高，GFP 荧光信号在进入溶酶体后由于 pH 值的下降会出现淬灭，而 mCherry 荧光基团进入溶酶体后仍能发出荧光。因此若细胞内出现绿和红色荧光共定位，即出现黄色荧光时，表明：mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白并未与溶酶体发生融合, 说明了自噬流被阻断。当细胞内仅出现红色荧光而无绿色荧光时，代表 mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白定位于溶酶体或自噬溶酶体内，即自噬流活化。

与 p27^+/+ 细胞相比，p27^-/- 细胞中自噬溶酶体的比例下降 (72% vs 95%)，进一步表明 p27 促进自噬流 (图 6b-c)。

(4) p27 促进自噬体成熟

图 7. p27 促进自噬体成熟过程的中间体形成
【a: p27^+/+ 和 p27^-/- MEFs 中，0 h 或 aa-剥夺 48 h 时, LC3B 和 p62 的免疫染色 (虚线描绘了 LC3B 阳性环状结构)；b: p27^+/+ 和p27^-/- MEFs 中 LC3B 环状聚集物的定量。】 

之前有文献表明 (参考文献 5)，自噬体在成熟过程中，LC3B 阳性自噬囊泡会聚集在细胞核周围形成环状聚集结构，这种结构被认为是自噬体成熟过程中的中间结构。如图 7a 所示，p27^+/+ 细胞中有明显的环状聚集体，但是在 p27^-/- 细胞中很少观察到，取而代之的是小囊泡结构。这表明 p27 可促进自噬体成熟过程。

总结

1、在长期氨基酸剥夺的情况下，与 p27^-/-  细胞相比，p27^+/+ 小鼠胚胎成纤维细胞中 LC3B-II 的上调，p62 蛋白表达量减少，自噬溶酶体数目比例增加，以及自噬体成熟过程环状聚集体的形成，可以证明 p27 在氨基酸长期匮乏的细胞中促进自噬流活化。

2、自噬流在细胞内是流动的细胞代谢过程, 自噬流中的任一环节出现障碍自噬将无法完成其生物学功能。尚无某种单一方法可以绝对准确特异的检测自噬，因此应该使用组合的实验方法来评估自噬活动 (自噬相关工具药物的使用，WB 检测自噬相关蛋白变化，免疫荧光共定位，以及 mCherry-eGFP-LC3B 双荧光检测等)。

3、足够的实验重复次数，合适的实验对照，乐观的心态也是实验成功的必要因素，M 君祝大家开学伊始，实验旗开得胜。

原文链接：DOI: 10.1038/s41556-020-0554-4.

相关化合物
Chloroquine Chloroquine phosphate	Autophagy 和 Toll-like receptors (TLRs) 的抑制剂。
Bafilomycin A1	抑制自噬 (Autophagy) 且诱导凋亡 (Apoptosis)。
Hoechst 33342	发蓝色荧光的 DNA 染料，可以透过细胞膜。
E64d	溶酶体蛋白酶抑制剂，可用于自噬流检测。
Leupeptin	溶酶体蛋白酶抑制剂，可用于自噬流检测。
Pepstatin A	溶酶体蛋白酶抑制剂，可用于自噬流检测。
自噬激活剂	包含 Rapamycin，MG-132 等 600+ 种有效的自噬激活剂。
自噬抑制剂	包含 3-Methyladenine (3-MA) ，Resatorvid (TAK-242) 等近 200 种有效的自噬抑制剂。
自噬化合物库	收录了 900+ 种自噬信号通路相关的产品，是研究自噬相关调控及疾病的有用工具。

精彩往期◆ 2020 MCE 畅玩开学季 | “鼠喔萌”，最懂你~◆ Hello~自噬◆ 细胞焦亡——促炎的细胞程序性死亡方式◆ 干货丨药界新宠—— LYTAC 与靶向蛋白降解技术

参考文献 

↓ 下滑查看更多文献 

1. Ada Nowosad, et al. p27 controls Ragulator and mTOR activity in amino acid-deprived cells to regulate the autophagy-lysosomal pathway and coordinate cell cycle and cell growth. Nat Cell Biol. 2020 Aug 17.
2. Prashanta Kumar Panda, et al. Chemical Screening Approaches Enabling Drug Discovery of Autophagy Modulators for Biomedical Applications in Human Diseases. Front Cell Dev Biol. 2019 Mar 19; 7: 38.
3. Maria Condello, et al. Targeting Autophagy to Overcome Human Diseases. Int J Mol Sci. 2019 Feb 8; 20 (3): 725.
4. Liang, J. et al. Te energy sensing LKB1-AMPK pathway regulates p27kip1 phosphorylation mediating the decision to enter autophagy or apoptosis. Nat. Cell Biol. 9, 218-224 (2007)
5. Saori R Yoshii, et al. Monitoring and Measuring Autophagy. Int J Mol Sci. 2017 Aug 28; 18 (9): 1865.
6. Mizushima, N. & Klionsky, D. J. Protein turnover via autophagy: .implications for metabolism. Annu. Rev. Nutr. 27, 19-40 (2007).
7. Stefanie Jäger, et al. Role for Rab7 in maturation of late autophagic vacuoles. J Cell Sci. 2004 Sep 15; 117 (Pt 20): 4837-48.

喜欢的话点亮在看吧~