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“魔剪” CRISPR/Cas9,你 get 到了吗?

小 M MCE 抑制剂
2024-09-04


CRISPR/Cas9 作为一种高效且广泛应用的基因编辑方法,迅速成为研究的热点。近年来,随着人们对 CRISPR/Cas9 技术研究的深入,打开了恶性肿瘤和遗传病治疗的新视角。小分子何助力 CRISPR/Cas9,如何做到“如虎添翼”




基因编辑, “何方神圣”

基因编辑是一种对靶基因或转录产物进行敲除、插入和定点突变等精确修饰的基因工程技术,主要通过人工核酸酶实现对基因组的特定基因序列的敲除、插入或精确修饰。目前,主要有三大基因编辑技术,包括:锌指核酸酶 (Zinc finger nucleases; ZFNs) 技术,转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like (TAL) effector nucleases; TALENs) 技术和 CRISPR/Cas9 技术。

ZFNs 是最较早用于基因组编辑的人工合成的限制性内切酶,该酶是异源二聚体,包含 DNA 结合锌指蛋白 (ZFP) 结构域和非特异性 FokI 核酸酶结构域。DNA 切割域的 FokI 核酸酶必须二聚化以切割 DNA。该技术已被用于修饰各种生物体内的内源性基因。

与 ZFNs 的模块化结构一样,TALENs 的羧基末端也含有 FokI 核酸酶结构域,它借助 TALEs (来源于植物致病性黄单胞菌属细菌) 来识别特异性 DNA 碱基对。相较于 ZFNs 技术,其优势在于可以定点识别靶基因,从而使得基因编辑更加准确高效,其脱靶效应以及细胞毒性也得到了显著改善。

图 1. 不同基因编辑手段的对比


2020 年,两位女性科学家 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因发现 CRISPR/Cas9 基因剪刀,而获得 2020 年诺贝尔化学奖。


CRISPR/Cas 系统由一小段 RNA 和一种高效的 DNA 切割酶 (Cas 核酸酶) 组成的系统,该技术不像 TALENs 技术和 ZFNs 技术是依赖于蛋白与靶基因之间的识别,而是由 sgRNA 和靶基因之间形成复合物,从而完成特定基因序列的编辑


CRISPR/Cas9 技术切割效率相对较高且操作简单,并且可以同时进行多位点的编辑。总之,三种不同的基因编辑技术都有其各自的特点。今天小 M 的“重头戏”,CRISPR/Cas9。 


CRISPR/Cas9 的调控机制

细菌及古细菌中,CRISPR 系统共分成 3 类,其中 I 类和 Ⅲ 类需要多种 CRISPR 相关蛋白 (Cas 蛋白) 共同发挥作用。而来自 Streptococcus pyogenes 的 Ⅱ 型系统只需要一种 Cas 蛋白 (Cas9) 即可发挥核酸内切酶活性。因此,CRISPR/Cas9 系统应用最为广泛。CRISPR/Cas9 系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞。 


■ 第一步:捕获外源 DNA

Cas9 蛋白包含两个核酸酶结构域:切割非互补 DNA 链的 RuvC 结构域和切割互补 DNA 链的 HNH 结构域 (如图 2a)。

噬菌体等外源 DNA 入侵时,CAS 蛋白复合物通常识别 3' 端含 NGG 的前间隔序列邻近基序 (PAM) 区域。然后,侵入的噬菌体或质粒释放的短 DNA 片段(称为 Protospacer),插入宿主 CRISPR 位点中 (由重复序列隔开)。


■ 第二步:crRNA 合成 

CRISPR 序列转录,形成前体 CRISPR RNA (pre-crRNA)。Cas9 及 RNase III 在 tracrRNA 与 pre-crRNA 上的重复序列配对形成双链 RNA 的条件下,对 pre-crRNA 进行剪切,形成成熟的 tracrRNA-crRNA 双链 RNA (即 sgRNA)。Cas9 核酸酶和 sgRNA 形成 Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。


■ 第三步:靶向干扰

当外源 DNA 再次进入细胞时,Cas9 蛋白携带sgRNA,去识别外源 DNA 的 Protospacer (前间隔序列),并与之结合,通过 Cas9 解旋酶和核酸酶对靶基因进行剪切。造成靶基因 DNA 的双链断裂 (DSB),从而达到干扰靶基因表达的目的,在复断裂同时引入基因敲除或敲入

图 2. 通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 内源性修复双链 DNA 断裂[2]


综上,CRISPR 技术主要是利用位点特异 Cas 核酸酶在基因组靶位点处引入 DNA DSB,再经细胞自身的非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组修复 (HDR) 对 DSB 进行修复,最终实现目标基因敲除和碱基编辑等基因组遗传修饰。


CRISPR/Cas9 的小分子调控策略

CRISPR 技术在疾病治疗、基因功能调控、药物研发等多个方面具有广阔的应用前景,但也存在脱靶、基因毒性等副作用问题。由于 Cas9 蛋白和 sgRNA 在其自身活性、识别位点及结合能力等方面的不同特性,在应用中可以通过对 Cas9 蛋白酶及与靶 DNA的结合进行有效的调控目前,如:遗传调节、小分子激活剂、小分子抑制剂、生物响应性输送载体以及 CRISPR/Cas9 系统的光/热/超声/磁激活等方法已被研究开发。

■ 小分子激活剂控制 Cas9 活性的策略

可通过添加小分子来控制 Cas9 的构象变化,来实现对 Cas9 蛋白活性的时空控制。


案例 1:当内含肽插入 Cas9 蛋白的不同位点,Cas9 核酸酶失活;添加 4-HT (4-hydroxytamoxifen),通过构象变化和自切割反应去除内含肽,可重新激活 Cas9 蛋白(图 3a)。根据内含肽的插入位点,Cas9 的激活效率 3 倍到 10 倍不等,与野生型 Cas9 相比,这种调控策略可增加开/脱靶效应比率。


图 3. 小分子激活剂控制 Cas9 活性的策略[9]

a:通过 4-HT 结合,恢复失活的 Cas9 活性;b:Cas9 和雌激素受体 (ERT2) 的融合被分离在细胞质中,通过添加 4-HT 使得融合物进入细胞核,形成 Cas9/sgRNA 复合物

案例 2基于化学诱导的 Cas9 蛋白分裂片段的二聚化。Zetsche 等设计了不同的分裂位点 (Arg535 和 Glu573) 生成分裂 Cas9 (split-Cas9) 蛋白,同时产生 C 端和 Cas9 片段 (可分别与 FK506  结合蛋白 (FKBP) 和 FKBP 雷帕霉素结合结构域 (FRB) 结合)。这种方法通过雷帕霉素诱导的异源二聚作用实现了 split-Cas9 的条件重构和激活。


图 4. 小分子激活剂控制 Cas9 活性的策略[9]


■ 小分子抑制剂控制 Cas9 活性的策略

由于 Cas9 活性的升高和持续可能会导致脱靶效应、染色体易位和遗传毒性,因此在目标编辑后,Cas9 核酸酶活性必须迅速限制在一个狭窄的时间范围内。


如下图 5 所示,DHFR (ER50)是一个不稳定的结构域,可快速靶向 Cas9 蛋白进行蛋白酶体介导的 Cas9 降解,但添加小分子抑制剂甲氧苄氨嘧啶 (TMP) 或 4-OHT 后可以使其稳定。用 Cas9-DHFR 或 Cas9-ER50 系统编辑 VEGFA 基因时,用不同剂量的TMP 或 4OHT 剂量依赖性控制靶向 VEGFA 基因的复合物 Cas9-DHFR (ERR50) 的靶向和非靶向活性。 


图 5. 小分子抑制剂控制 Cas9 活性的策略[9]


总结
CRISPR-Cas9 系统已成为一种在任何细胞基因组的精确位置进行修改的有效工具。Cas9 介导的 DNA 切割后发生的主要细胞修复途径是错误的非同源末端连接 (NHEJ) 途径。同源定向重组 (HDR) 的效率远远低于 NHEJ。因此,降低 NHEJ 的频率,同时增加 Cas9 介导的 DNA 切割后的 HDR 效率,从而提高基因组编辑的整体效率和精准度成为科学家关注的焦点。与此同时,通过研究人员的不断努力,生物活性小分子提供了一种简单而有效的调控策略,可进一步拓宽精确基因组编辑的应用范围。

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参考文献


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1. Gibson GJ, Yang M. What rheumatologists need to know about CRISPR/Cas9. Nat Rev Rheumatol. 2017 Apr;13(4):205-216.

2. Westermann L, Neubauer B, Köttgen M. Nobel Prize 2020 in Chemistry honors CRISPR: a tool for rewriting the code of life. Pflugers Arch. 2021 Jan;473(1):1-2.

3. Dominguez AA, Lim WA, Qi LS. Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Jan;17(1):5-15.

4. Matano M, Date S, Shimokawa M, Takano A, Fujii M, Ohta Y, Watanabe T, Kanai T, Sato T. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nat Med. 2015 Mar;21(3):256-62.

5. Yang H, Wang H, Shivalila CS, Cheng AW, Shi L, Jaenisch R. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013 Sep 12;154(6):1370-9.

6. Sánchez-Rivera FJ, Jacks T. Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology. Nat Rev Cancer. 2015 Jul;15(7):387-95.

7. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.

8. Zalatan JG, Lee ME, Almeida R, Gilbert LA, Whitehead EH, La Russa M, Tsai JC, Weissman JS, Dueber JE, Qi LS, Lim WA. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 2015 Jan 15;160(1-2):339-50.

9. Zhuo C, Zhang J, Lee JH, Jiao J, Cheng D, Liu L, Kim HW, Tao Y, Li M. Spatiotemporal control of CRISPR/Cas9 gene editing. Signal Transduct Target Ther. 2021 Jun 20;6(1):238.

10. Maji B, Gangopadhyay SA, Lee M, Shi M, Wu P, Heler R, Mok B, Lim D, Siriwardena SU, Paul B, Dančík V, Vetere A, Mesleh MF, Marraffini LA, Liu DR, Clemons PA, Wagner BK, Choudhary A. A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9. Cell. 2019 May 2;177(4):1067-1079.

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