免疫沉淀常见问题解答

在细胞世界里，没有蛋白是一座孤岛，都需要与其他蛋白发生相互作用而发挥功能。找 “蛋白朋友” 最常见的方法便是免疫沉淀 (IP)/免疫共沉淀 (Co-IP)。免疫沉淀磁珠是偶联了配体的超顺磁性聚合物微球，可以实现快速、简单、高效的 IP/Co-IP/Pull-down 等实验。

(PS：此篇抛砖引玉，大家要学会举一反三哦）

磁珠是何方神圣？ 如何慧眼识“珠”？

生物磁珠一般是具有细小粒径 (μm) 的超顺磁微球。具有以下特点：

1) 超强顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能均匀分散；

2) 合适且均一的粒径，保证其具有足够强的磁响应性又不会沉降；

3) 丰富的表面活性基团，以便和生物分子偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。

图 1. MCE 磁珠组成

A、G、L、A/G 代表 Protein A、Protein G、Protein L 及 Protein A/G；

Anti-HA、Anti-Flag、Anti-c-Myc、Anti-GST 代表 Anti-HA 抗体、Anti-Flag 抗体、Anti-c-Myc 抗体及 Anti-GST 抗体

选磁珠时，首先关注磁珠磁性 (磁吸时间)、粒径 (大小及均一度) 等。其次根据实验目的，选择合适的表面活性基团以及由此衍生的偶联方式、蛋白结合量等。

比如，如果您的目标蛋白带有融合标签，可一步到位选择：

· Anti-HA Magnetic Beads (HY-K0201)

· Anti-Flag Magnetic Beads (HY-K0207)

· Anti-c-Myc Magnetic Beads (HY-K0206)

· Anti-GST Magnetic Beads (HY-K0222)

如果您的目标蛋白带有生物素标记，可选择

· Streptavidin Magnetic Beads (HY-K0208)

如果您有可识别靶蛋白的抗体，可选择

· Protein A/G Magnetic Beads (HY-K0202)

· Protein A Magnetic Beads (HY-K0203)

· Protein G Magnetic Beads (HY-K0204)

· Protein L Magnetic Beads (HY-K0205)

下面以 Protein A/G 磁珠为例，详述 IP 实验步骤、可能存在的问题及解决方法。

■ Step 1——抗原样品制备

制备抗原样品 (细胞裂解物) 是 IP 的第一步，也是关键的一步。正确的细胞裂解液可以稳定天然蛋白质构象、抑制酶活性、最大限度地减少抗体结合位点变性并释放细胞或组织中的蛋白质。一般可选 NP-40、RIPA、Western 及 IP 细胞裂解液等。抗原样品应始终保存在冰上，并将蛋白酶抑制剂 添加到裂解液中以防止蛋白水解。

注 1：Co-IP 实验时，常用 NP-40 等非离子型裂解液，以免破坏蛋白-蛋白相互作用。

注 2：确保目的蛋白在抗原样品中有较高水平表达。

图 2. 培养、收集、裂解细胞，释放靶蛋白
■ Step 2——样本结合

通过此步骤，您将获得磁珠—抗体—抗原样品复合物。磁珠、抗体、抗原样品的加样顺序对靶蛋白得率有一定影响。

图 3. 常见 IP 实验的样本结合步骤

All in one——直接将磁珠、抗体、抗原样品混合到一起；

直接结合——抗体和磁珠先结合，再和抗原样品结合；

间接结合——抗体和抗原样品先结合，再和磁珠结合。

可选步骤 1——抗原样品预处理：为减少非特异性结合，可将抗原样品单独与 Protein A/G 磁珠或同型对照抗体结合。(预处理有助于去除在 IP 过程中可能与抗体或磁珠非特异性结合的分子，从而改善信噪比。)

可选步骤 2——抗体的交联固定：如果不希望抗体与目标蛋白共洗脱，可在直接结合时，使用交联剂将抗体共价连接到 Protein A/G 上。后续使用酸性洗脱法洗脱靶蛋白。

(直接将磁珠、抗体、抗原样品混合到一起，速度最快，但获得的靶蛋白纯度和得率会很低；间接结合靶蛋白得率最高，但在洗脱步骤时，抗体会和靶蛋白一起被洗脱；直接结合，蛋白得率也较高，且可通过交联固定抗体，达到单独洗脱靶蛋白的目的。)
一般情况下，如果靶蛋白丰度较高，直接结合与间接结合差别不大，均可选；如果靶蛋白丰度不高，可选间接结合以获得更高的靶蛋白得率。
样本结合步骤中的结合/洗涤缓冲液也非常重要。一般情况下，您的结合/洗涤缓冲液可以为同一种缓冲液，如 TBST/PBST。另外可通过加入去垢剂 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加盐离子浓度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗涤次数等来提高洗杂效率。

■ Step 3——抗原洗脱

一般根据下游应用选择洗脱方法：

图 4. 常见抗原洗脱方法

1) 变性洗脱法：如果下游分析是用免疫印迹 (Western Blot)，则通常直接使用 SDS-PAGE Loading Buffer 进行洗脱 (95°C 加热 5 mins)。该缓冲液可使蛋白质变性还原并用于电泳，十分高效，适用于亲和作用的解离。但该方法也会洗脱下抗体等非靶分子，且获得的蛋白不具备生物活性。

2) 酸性洗脱法：0.1 M-0.15 M 甘氨酸 (pH 2.5-3) 是 IP 中最高效的非变性洗脱缓冲液，低 pH 水平可以解离大多数抗体-抗原相互作用。此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。但酸性洗脱不是万能方法，采用该缓冲液可能无法解离某些抗体—抗原相互作用，而且部分抗体对低 pH 环境敏感。

注 1：在洗脱前的接收管中提前加入中和液，可缓解抗体对于低 pH 环境的敏感。

注 2：低 pH 水平也可以解离未交联情况下的抗体—Protein A/G 相互作用。如果不希望抗体与靶蛋白共洗脱，可在样本结合步骤时，使用交联剂将抗体共价连接到 Protein A/G 上。而后再用酸性洗脱法洗脱靶蛋白。

3) 竞争性洗脱法：如果靶蛋白带有标签，可用高浓度标签或配体进行竞争性洗脱。如 Flag 标签蛋白，可用 3×Flag peptide 竞争性洗脱，此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析，而且还没有抗体片段污染。

■ Step 4——WB 验证

设计好实验，优化好条件，配好各种 buffer 和工作液，按照 protocol，小心翼翼的丝毫不敢怠慢，一通操作猛如虎，一看结果。

1) 靶蛋白信号微弱或无信号

灵魂五问：蛋白表达了吗？上样量足够吗？孵育时间充足吗？裂解液选的合适吗？洗脱方法合适吗？

图 5. IP 组信号微弱或无信号，Input 组有条带，IP 组没条带或条带很弱

解决方案详戳 “冬风吹，战鼓擂，蛋白纯化，我怕谁！

2) 高背景值或多条带

a. 优化蛋白上样量，IP 时总蛋白上样量过多可能会造成非特异性结合，建议上样量为 1 mg 左右；蛋白电泳时，优化上样量以观察特定信号；

b. 优化洗涤缓冲液，通过向洗涤缓冲液中加入去垢剂 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加盐离子浓度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗涤时间、洗涤次数等降低背景；

c. 非必需的高强度洗脱缓冲液 (如 SDS-PAGE 上样缓冲液) 将导致多种非特异蛋白 (如Protein A/G 或链霉亲和素亚基) 与抗原一起被共洗脱下来。温和的缓冲液 (如 0.1 M 甘氨酸，pH 2.5) 可以防止此类污染；

d. 抗体污染问题：参考前面关于抗体交联固定的讨论或使用不同种属的一抗进行 IP 和蛋白质免疫印迹检测；

e. 使用恰当的蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解；

f. 对抗原样品预处理 (将抗原样品单独与 Protein A/G 磁珠或同型对照抗体结合)，可减少部分非特异性结合。

3）阳性及阴性对照设置

成功的条带总是相似的，失败的条带各有各的不同。分析结果时，有阴性、阳性对照能一步到位帮您分析原因。

阳性对照：证实细胞裂解物中确实存在靶蛋白 (IP) 或者互作蛋白对 (Co-IP，比如诱饵蛋白 X 和靶蛋白 Y)，即为常说的 input。可直接使用细胞裂解物或者抽提好的蛋白溶液进行 Western Blot。

阴性对照：IP/Co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白对都检测到了，固然是值得高兴的，但是这结果是不是假阳性呢？还得做个阴性对照。例如，同型对照抗体 (没有特异靶标的一抗，但在类别和亚型上，其跟实验应用中的靶标一抗一致) 等。

Output：在某些 Co-IP 实验中，实验人员会把 IP 后的上清分别进行诱饵蛋白 X 和靶蛋白 Y 的 WB 检测，该对照组称为 output 组。

......

好了，说了这么多，希望本篇对大家有所帮助，祝伙伴们拿到心仪的实验结果。

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