实验操作 | 免疫组化 (IHC) 操作步骤 + 注意事项！
IHC 检测可分为直接法 (又称一步法) 和间接法 (二步、三步或多步法)。直接检测方法是直接与偶联物 (例如荧光染料、酶、胶体金或生物素) 结合标记的一抗的一步过程。直接法快速，但对于检测常规处理的组织中的大多数抗原缺乏足够的灵敏度 (图 2)。
为了满足灵敏度更高的抗原检测的需求，Coons 等人开发了一种两步法。第一层抗体未标记，而第二层抗体 (针对一抗而产生) 则被标记 (图 2)。
间接法可以用较少的一抗检测较少量的抗原，用于放大一抗信号，因为一个一抗至少可以结合两个带标记的二抗。 间接法也比直接法更方便，因为相同的二抗可用于检测不同的一抗，前提是后者是在同一物种中产生的。
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样本固定
目的
1) 充分保存细胞成分，包括可溶性和结构性蛋白质；
2) 防止细胞成分 (包括抗原和酶) 自溶和置换；3) 稳定细胞材料，避免后续程序产生有害影响；4) 便于常规染色和免疫染色[1]。甲醛是常规组织学和免疫组织化学固定剂的金标准。甲醛主要保存肽和细胞器的一般结构。
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基本步骤：
1）取材：从动物或人体取得所需的组织样本。对于组织块，要确保其大小适中，不宜过大，以便于固定液能够充分渗透。2）初步处理：如果组织样本带有血液或其他体液，应先用生理盐水或 PBS 进行冲洗，以去除这些可能影响固定效果的物质。
3）固定：将组织样本放入固定液中。常用的固定液包括 10% 中性缓冲福尔马林 (Formalin，也称为甲醛)、甲醇、乙醇或它们的混合液等。固定液的量通常为组织体积的 10-20 倍，以确保组织能够充分浸入固定液中。大组织标本应切开固定，以免中间部分自溶解腐败。
☑ 固定时间根据组织类型和实验要求而定，一般固定时间室温 18-24 h。4）固定后的处理：固定完成后，将组织从固定液中取出，用流水冲洗数分钟，以去除残留的固定液和可能产生的结晶。
固定的时间不宜过长，以免导致组织过度硬化和抗原性的丧失。 固定的温度通常为室温或 4°C，避免高温导致组织损伤。
在固定过程中，要确保组织样本完全浸入固定液中，避免出现未固定的部分。
固定的容器应干净、无杂质，避免对组织造成污染。
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包埋
目的
保护和支撑组织样本，以便在切片时保持其完整性。通过将组织样本嵌入到固体介质中，可以制作出适合在显微镜下观察的薄切片。
常用的包埋介质包括石蜡、树脂等。石蜡包埋是免疫组化中最常用的方法，因为它可以有效保存组织形态，提升切片质量。树脂包埋则常用于需要更高分辨率或特殊染色方法的样本。
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基本步骤：
1）脱水：在组织样本固定后，需要将其中的水分去除，以便于包埋介质能够充分渗透。酒精梯度脱水: 75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇 (I)、无水乙醇 (II) 分别浸泡 30-60 min (5mm 组织块为例)。
2）透明：脱水后，组织样本会变得不透明，需要使用透明剂（如二甲苯）来去除其中的酒精和其他溶剂，使组织样本变得透明。通常用二甲苯浸泡两次，每次浸泡 30min。3）浸蜡：将透明后的组织样本放入熔化的石蜡中，让石蜡充分渗透到组织样本中。这个过程通常需要在温箱中进行，以确保石蜡的均匀渗透。4）包埋：将浸蜡后的组织样本放入模具中，倒入熔化的石蜡，然后让石蜡冷却凝固。这样，组织样本就被包埋在石蜡中了。
在包埋过程中，要控制好温度和时间，以确保石蜡的均匀渗透和组织的完整性。 包埋后的组织块需要冷却凝固后才能进行切片。在冷却过程中，要避免过度冷却导致石蜡碎裂或组织变形。
在包埋前，要对组织样本进行充分的固定和脱水处理，以确保其抗原性和完整性。
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切片
目的
将包埋后的组织样本切割成薄片，以便于在显微镜下观察和检测。
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基本步骤：
1）切片前的准备：确保包埋后的组织块已经充分冷却并固化。使用适当的切片机进行切片。2）切片：将包埋好的组织块固定在切片机的样本夹上。调整切片机的切片厚度，通常为 4-5 微米厚，这个厚度是根据需要检测的抗原和实验要求来确定的。
3）展片：使用刷子或毛笔轻轻地将切好的组织切片从刀上取下，并放在温水 (40℃) 中展开。
4）烤片：60℃ 烤片 2 h。
在切片过程中，要控制好切片机的速度和切片刀的锋利度，以获得高质量的切片。 切片后，要及时对切片进行处理，以避免抗原的损失和组织的变性。
使用适当的黏贴剂，确保切片牢固地附贴在载玻片上，以便于后续的免疫组化实验。
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脱蜡水化
目的
将组织切片从石蜡中释放出来，并使其恢复到适合进行后续抗原检测和染色的状态。
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基本步骤：
1）脱蜡：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蜡。通常，这个过程会分为多个步骤，每步大约持续 5 分钟，以确保石蜡被完全去除。例如，可以使用二甲苯 Ⅰ、二甲苯 Ⅱ 和二甲苯 Ⅲ 分别浸泡 5 min。
2）水化：依次置于无水乙醇 I、无水乙醇 II，95% 乙醇、85% 乙醇和 70% 乙醇中，各浸泡 1 次，5 min/ 次；再放入纯化水中清洗浸泡 5 min。
彻底脱蜡：脱蜡过程必须彻底，以确保石蜡被完全去除。否则，残留的石蜡会影响后续的抗原检测和染色。 避免干燥：在整个脱蜡水化过程中，应确保切片始终保持在湿润的状态，避免干燥。干燥会导致非特异性抗体结合，从而出现高背景染色。
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抗原修复
目的
重新暴露或修正这些被封闭或扭曲的抗原，以提高免疫组化实验中的抗体与抗原的结合率，增强信号的强度和特异性[3]。
最常用的修复缓冲液是 10 mM 的 pH 6.0 枸橼酸钠、pH 9.0 的 Tris-EDTA 、pH 8.0 的 EDTA。建议测试多种方法以寻找染色效果最佳的方法。
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抗原修复的方法：
(1) 微波热修复：加入抗原修复液，放入切片，置于微波炉中火 8 min，停火 7 min，转小火 8 min；取出染色盒，冷却至室温。(2) 水浴热修复: 加入抗原修复液，放入切片，置于水溶锅中加热，其间不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效度 (92℃)，维持 40 min 后取出染色盒，冷却至室温。(3) 高压热修复: 在染色盒中加入抗原修复液，放入切片，置于高压锅内加热至饱压后继续加热 5 min，关闭电源，10 min 后取出染色盒，冷却至室温。
(4) 酶解修复：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。将切片置于含有酶解液的载玻片上，然后在适当的温度和湿度条件下进行酶解 (通常为 37°C，20 min)。酶解后，同样需要冷却切片至室温再进行后续处理。
加热后需自然降温； 使用过量的抗原修复液；
修复液的不同 pH 值对染色结果的影响比较大；
没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。不同的抗体可能需要不同的抗原修复方法和条件，因此需要根据实验要求和抗体特性选择合适的抗原修复方法。
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灭活
目的
消除细胞或组织中内源性酶和活性物质的影响，降低背景噪音，提高实验的特异性和敏感性[4]。
(1) 灭活内源性过氧化物酶：HRP 检测系统，常用的去除内源性过氧化物酶的方法是 3% 过氧化氢水溶液，室温 10 min。(2) 洗涤：用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤切片、浸泡 2 次，5 min/ 次。
H2O2 需现用现配，且 4℃ 避光保存，否则易引起非特异背景。 H2O2 孵育时间过长也会易引起脱片。
部分组织还含有内源性碱性磷酸酶，可用左旋咪唑进行灭活。
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封闭
目的
封闭组织切片上非特异性结合位点，防止抗体与这些位点结合，从而减少背景信号。
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基本步骤：
1）非特异位点封闭：将封闭液 (如 5% BSA 或血清等) 滴加到组织切片上，确保封闭液均匀覆盖整个组织区域。然后将切片放入湿盒中，在室温或 37°C 下孵育 30 min，让封闭液与组织切片充分作用。2）洗涤：封闭结束后，用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤切片，以去除未结合的封闭液和可能存在的杂质。
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一抗孵育
免疫组化中的一抗孵育是免疫组化实验的关键步骤之一。向上滑动阅览
基本步骤：
1）选择一抗：根据实验目的选择特异性高、亲和力强的一抗。一抗应该与目标抗原的种属来源、类型等相匹配。
2）稀释一抗：根据一抗的效价和实验要求，用适当的稀释液 (如 PBS、TBS 等) 稀释一抗。3）涂覆一抗：将稀释好的一抗均匀涂覆在已封闭的组织切片上，确保抗体能够充分接触组织切片上的抗原。4）孵育：将稀释好的一抗均匀滴加在已封闭的组织切片上，放入湿盒中，室温 (或 37°C) 孵育 1 h，使一抗与抗原充分结合。
确保一抗的质量和特异性，避免使用过期或质量不佳的一抗。 充分洗涤组织切片，去除未结合的一抗和其他杂质，减少背景染色。
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二抗孵育
二抗的作用是与一抗结合，形成抗原-抗体-抗体复合物，从而增强信号的强度和特异性。
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二抗孵育的基本步骤：
1) 稀释二抗：参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液或其他适当的溶液稀释二抗。2) 孵育二抗：将稀释好的二抗滴加在已经过一抗孵育并洗涤的组织切片上，室温孵育 30 min-60 min。
3) 洗涤：孵育完成后，使用洗涤液 (如 PBST 或 TBST) 在摇床上缓慢摇动洗涤切片，以去除未结合的二抗和其他杂质。洗涤通常需要重复几次，每次洗涤时间一般为 5-10 分钟。
二抗的选择和稀释比例应根据实验的具体要求和一抗的特性来确定。
对于抗体的选择还有疑惑的小伙伴可以翻翻小 M 的往期推文：官宣! MCE 迎来了一位新成员——抗体10
显色
显色检测中需要考虑的其他因素有酶和显色底物的选择。每种检测酶都有几种不同的显色剂。HRP-DAB 是最常用的显色剂组合。
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基本步骤：
1）加入酶的底物 (如 HRP 的底物为 DAB，AP 的底物为 BCIP/NBT)。2）底物在酶的作用下发生化学反应，形成有色沉淀物，通常呈现棕色 (对于HRP-DAB 系统) 或蓝色 (对于 AP-BCIP/NBT 系统)。
3）通过显微镜观察组织切片上的颜色变化，可以确定抗原在细胞或组织中的位置和表达水平。
选择适当的检测系统：根据实验目的和样本特性选择合适的检测系统； 优化条件：对一抗、二抗的浓度、孵育时间和温度等条件进行优化，以获得最佳的检测结果。
注意防护：DAB 为联苯偶氨化合物，可诱发皮肤癌和膀胱症，在显色操作过程中需注意防护。
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复染
为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可进行复染[5]。
复染：滴加 80-100 μL 苏木素染色液至完全覆盖组织，室温孵育 5 min，自来水冲洗返蓝。
复染的时间是需要摸索的，这个与苏木精的配制时间有关。 如果染色过浅可重复染色，如果染色过深可使用盐酸进行分化。
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封片观察
在免疫组化实验中，封片观察是最后的步骤，用于保护组织切片、增强对比度和稳定性，并允许在显微镜下进行长期观察和分析。
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封片步骤：1）脱水：在完成所有染色步骤后，通常需要将组织切片进行脱水处理，以去除切片上的水分。切片依次使用 70%、85%、95% 乙醇、无水乙醇 I、无水乙醇 Ⅱ 分别浸泡 1 min。2）透明：脱水后，切片需要进行透明处理，以便封片剂能够均匀分布在切片上。通常使用二甲苯浸泡两次，每次 1 min。
3）封片：将一滴封片剂 (如中性树胶、甘油明胶等) 滴在组织切片上，然后用盖玻片轻轻覆盖。封片剂的选择取决于实验要求和标本类型。封片时要确保没有气泡产生，并且盖玻片与切片之间紧密贴合。
4）干燥：让封片剂自然干燥，或者可以在温箱中加速干燥过程。干燥后的切片可以长期保存，并随时用于观察。
封好的切片可以长期保存，但应放置在干燥、避光、温度适宜的环境中，以避免切片受潮、褪色或损坏。 封片剂和某些化学试剂可能对人体有害，因此在进行封片操作时要注意安全防护措施，如佩戴手套、眼镜等。
▐ Q2：产生非特异性染色？
在使用检测进行诊断之前，必须了解反应在细胞或组织内的预期抗原分布。如下图所示，CD79a 抗体仅染色了浆细胞瘤细胞的细胞核。根据目前对该抗原位置(细胞质和细胞质膜) 的了解，该反应被认为不是特异性的。
注：非特异的原因也有是因为修复方式不对，可能是修复太强了。
下部插图是异常染色的细节；上部插图描绘了浆细胞瘤中 CD79a 的典型细胞质染色。条 = 60 μm，两个插图条 = 5 μm。
2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高 (含血细胞多的组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
4）非特异性组分与抗体结合，需延长封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
5）DAB 孵育时间过长或浓度过高；
6）洗涤不充分，可增加洗涤次数和洗涤时间；
7）染色过程中出现干片。干片容易导致非特异性染色，实验过程中需避免干片。
2）确认试剂是否遗漏，添加顺序是否正确；
3）抗原修复条件不合适，摸索最合适抗原修复条件；
4）组织切片本身这种抗原含量低，建议用已知阳性样本作阳性对照。
2）是否有效去除内源性酶和生物素，可延长内源性酶灭活时间；
3）血清封闭时间是否过短，可延长封闭时间；
4）检查一抗的特异性是否良好，选择特异性高的抗体；
5）适当增加抗体孵育后的洗涤次数和延长洗涤时间。该抗体是偶联了 HRP 标记、山羊来源的抗兔 IgG 抗体。它可结合兔 IgG 抗体的轻链和重链，用于兔子背景下 WB、IHC-P、ELISA 实验。 |
[2] Amereh M,et al.Immunohistochemistry (IHC) staining of in-vitro cancer cell-generated tumoroids. MethodsX. 2023 Jun 3;10:102242. [3] Shi SR,et al.Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem. 1991 Jun;39(6):741-8.[4] Hussaini HM,et al.Immunohistochemistry and Immunofluorescence. Methods Mol Biol. 2023;2588:439-450.[5] Mebratie DY,et al.Review of immunohistochemistry techniques: Applications, current status, and future perspectives. Semin Diagn Pathol. 2024 May;41(3):154-160.[6] Ramos-Vara JA, et al. Suggested Guidelines for Immunohistochemical Techniques in Veterinary Diagnostic Laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2008;20(4):393-413.