Protein & Cell发表！辉大团队首次证明Retron系统可编辑哺乳动物细胞基因组
辉大基因团队的又一项重磅研究成果
登上了国际顶级学术期刊
近日，Protein & Cell发表了题为“ Precise Genome Editing without Exogenous Donor DNA via Retron Editing System in Human Cells ”的研究论文。该研究通过对Retron（反转录子）系统的进一步优化，首次证明了Retron系统在哺乳动物细胞中的可适用性，为该工具在高等真核生物细胞中的进一步应用提供了重要指导意义。
该研究由辉大（上海）生物科技有限公司（简称“辉大基因”）和中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（简称“中科院脑智卓越中心”）杨辉课题组共同合作完成。辉大基因作为第一作者单位，公司研发部孔祥锋博士、施霖宇博士和王兴博士作为主要研究人员参与了该项目研究工作。
▌Retron在基因编辑应用中独具优势
噬菌体与细菌与之间的攻防机制导致细菌发展出了精妙的防御系统，近年来生命科学领域最大的突破——CRISPR基因编辑技术，正是从细菌的防御系统发展而来。实际上，细菌除了CRISPR系统之外，还有其他防御系统，近来发现的Retron系统也在细菌防御噬菌体中发挥重要作用。
Retron是细菌的遗传元件，由一段非编码RNA和逆转录酶（RT）组成。转录酶以非编辑码RNA作为模板，逆转录产生与非编辑码RNA共价连接的单链多拷贝卫星DNA。以色列维茨曼研究所的Rotem Sorek团队2020年发表于Cell的研究论文，首次解析了Retron的功能，证实其是细菌抵抗噬菌体的防御系统。
CRISPR系统的出现极大地推动了精准基因编辑的发展，它具有很强的靶向性，但并不擅长在目标DNA中引入新序列。与之不同，Retron系统却可以通过逆转录酶制造大量靶标序列的副本，这些副本可以被有效地拼接到宿主基因组中。因此，如果将反转录子与CRISPR整合在一起，或许能开发出一种全新的、功能更强大的基因编辑工具。
实际上，早在2018年，斯坦福大学Hunter Fraser 研究组的研究人员就推出了一款基于Retron的基因编辑工具，并将其命名为CRISPEY。CRISPEY巧妙地将Retron系统与CRISPR系统结合，通过Retron系统在细胞内逆转录产生单链供体模板DNA, 并且将其与sgRNA共价偶联。在酵母细胞中，这一方法可以高效的完成精确编辑（>80%编辑效率），并且可以在酵母细胞中高效精确的敲入长达700bp的DNA序列。
尽管Retron系统在基因组编辑应用中显示出独特优势，但在哺乳动物细胞中能否发挥作用，此前一直未得到研究证明。
▌首次证明Retron可用于哺乳动物基因编辑
辉大基因此次发表于Protein & Cell的研究，首次证明了Retron系统可在哺乳动物细胞中进行基因编辑。
在这项研究中，团队首先通过将四种已被报道具有功能的Retron系统（Ec48、Ec73、Ec86和Ec107）在哺乳动物细胞内的表达，证明了细菌Retron系统能在哺乳动物细胞中逆转录产生单链DNA。然后，通过将Retron RT融合于Cas9蛋白的N端或C端，并将Retron ncRNA连接于sgRNA的5’端或3’端，这种改造后Retron编辑系统可以在哺乳动物细胞中有效地完成精准DNA编辑。
不过，当前基于Retron的基因编辑系统效率仍相对较低，Cas9的切割作用会产生较高水平的indel等问题。团队认为，后续还有很多策略可用于Retron editing系统的版本更新升级：
1.通过宏基因组数据分析挖掘新的可用于开发高效编辑工具的Retron系统；
2.通过蛋白进化改造提高当前retron RT的逆转录酶活性；
3.使用Cas9 nickase代替Cas9，以消除DSB造成的不良副产物。
相较于目前比较常用的DNA单碱基编辑及Prime editing，依赖HDR机制的Retron editing相对受到PAM位置限制比较小。同时，Retron editing系统不需要额外提供外源供体模板DNA。目前在植物细胞中由于HDR效率低及外源同源重组供体模板DNA递送困难等原因造成基因 (尤其是长片段) 敲入的效率较低，不需要提供外源供体模板DNA的Retron editing系统也许能为植物基因组编辑提供一个新的选择。
总的来说，该研究为Retron editing在哺乳动物细胞中的应用进行了初步探索。Retron editing应用于基因组编辑有其特有的优势，值得后续更多的优化升级工作，以期早日将Retron editing系统应用于临床疾病治疗及作物性状改良等领域。