每周答疑：与PCR技术有关的常见问题答疑——发明人凯利·穆利斯去世之际
有人说，生物学可以被划为两个时代：一个没有PCR，一个有PCR。这样的说法并不夸张。没有PCR（polymerase chain reaction多聚酶链式反应）技术，就没有现代分子生物学。我们所知道的人类基因组，所用上的精准抗癌药物，可能都还没有诞生。
PCR是一种在生物体外迅速扩增特定DNA片段的核酸合成技术，本文针对一些学生有关PCR技术的常见问题予以解答。
PCR的技术原理（图片来源：Enzoklop [CC BY-SA 3.0]）
1 PCR所需原料是普通的四种脱氧核苷酸吗?PCR反应体系为何不加ATP
加入PCR反应体系的并非普通的四种脱氧核苷酸, 而是四种脱氧核苷三磷酸 (统称d NTP) , 即:d ATP、d CTP、d GTP、d TTP (“d”代表“脱氧”;“T”代表“三个”;“P”代表“磷酸”“A、C、G、T”分别代表四种含氮碱基) , 它们是分别由四种普通的脱氧核苷酸在消耗ATP的基础上活化而成的。也就是说, d NTP的形成过程需要ATP供能。例如, d NDP+ATP→d NTP+ADP。因为d NTP是消耗ATP活化的脱氧核苷酸, 具备了反应所需能量, 所以PCR反应体系不用再添加ATP。
2 缓冲液有哪些作用
PCR缓冲液除了具备对p H变化的缓冲作用外, 还含有可以激活DNA聚合酶的Mg2+, 以及有利于引物和模板退火的K+, 还有DNA聚合酶的稳定剂等。所以通常含有KCl、Tris·HCl (p H=8.4, 室温) 、Mg Cl2、明胶等。Mg2+对Taq酶的活性和专一性都有影响, Mg2+的浓度高, 则Taq酶的活性加强而专一性降低, 所以,当Mg2+的浓度过高时, 通常会导致非特异性扩增产物的积累, 而浓度过低则会降低扩增量。通常Mg Cl2浓度为1.5mmol/m L左右。
3 d NTP、Taq酶、模板需要随时添加吗
PCR反应体系中, d NTP的浓度通常都是50~200μmol/L。浓度过高会导致复制发生差错。浓度为50~200μmol/L时, 足够合成6.5~25μg的DNA, 所以不需要随时添加d NTP。另外, d NTP会定量与Mg2+结合, 因此反应中的d NTP的含量又影响游离Mg2+的浓度。所以, d NTP浓度改变时也要相应改变Mg Cl2的浓度。
反应体系中的Taq酶 (DNA聚合酶) 是从水生嗜热菌 (Thermus aquaticus) YT菌株中分离得到的,这是一种真菌, 可在70℃~75℃条件下生长, 该酶耐高温, 90℃以上仍可保持活性。反应体系中一般加入2.5个单位的DNA聚合酶, 由于酶在每次反应前后保持数量基本稳定, 所以反应过程中也不需要添加Taq酶。
反应体系中一般加入模板102~105拷贝的模板。因为每次循环均可利用上一次合成的DNA作为模板, 所以不需要在反应过程中添加模板。
4 引物有什么作用?是否需要随时添加?设计引物有哪些注意事项
DNA聚合酶只能从脱氧核苷酸链的3ˊ-OH端添加单个脱氧核苷酸, 而不能直接起始一条新链, 即新合成的链沿5ˊ-OH→3ˊ-OH方向延伸。要扩增一段DNA, 必须先搞清楚待扩增的DNA两端的部分碱基序列, 以便根据已知序列设计两个由20个左右脱氧核苷酸组成的寡聚核苷酸链, 称为引物。当目的DNA经加热变性形成单链模板后, 引物和单链模板的3ˊ端序列互补结合。
然后Taq酶从引物的3ˊ-OH端按照模板的DNA碱基序列合成新生DNA链。在一次PCR过程中, 需要在反应体系中添加引物至0.25mmol/m L, 这样就足够反应进行30~40次循环, 而不需要在在在反应中添加引物。
在设计引物时, 还要注意两个引物之间不应该有互补性, 尤其应避免3ˊ-OH端的互补重叠, 以防止引物二聚体的形成。这种引物二聚体形成后, 在DNA聚合酶的作用下会使二聚体的每条链从3ˊ-OH端延伸, 形成一段新的双链DNA片段, 而此双链DNA片段会作为新模板而被扩增, 从而导致PCR扩增的主要产物为这种新形成的DNA片段, 而非要求的DNA片段。所以, 一对引物之间不能多于4个碱基的互补性。
设计引物时, 还要注意引物自身不应存在互补序列, 否则会造成自身折叠形成发夹结构或自身复性, 从而影响引物和模板的复性结合。所以引物自身连续互补碱基不能大于3个。
5 退火时, 为何引物优先与母链结合, 而不是两条互补的模板链结合
反应体系加热至90℃~95℃, 使模板DNA变性, 解开为单链。退火时冷却至55℃~60℃,此时由于引物分子较小, 运动较快, 和母链碰撞的机会要多得多, 所以优先与模板链结合。引物不可太大, 一般不能超过30个脱氧核苷酸长度, 否则会导致退火时不能激发模板, 即引物不能优先和模板链结合, 而是较多的互补模板链互相结合。
资料：刘本举：与PCR技术有关的常见问题答疑，生物学教学，2012
相关高考题在线：
1.[2011年·江苏，33]请回答基因工程方面的有关问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
②在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。
①第1组： ；
②第2组： 。
(3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 。
(4)用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。
【答案】
(1)①15/16 ②三
(2)①引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
②引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(3) DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上
(4)见右图
2.[2017年·全国III，38][生物——选修3：现代生物科技专题]（15分）
编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
（1）先要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是________。
（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了________作为合成DNA的原料。
（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是_______。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是_______。
②仅根据图、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少_______（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
答案：
38.
（1） 编码乙的 DNA 序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子
（2） 模板 dNTP
（3）①进行细胞传代培养 维持培养液的pH ② C
3.[2019年·全国卷I,38]【生物—选修3:现代生物科技专题】
基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括 和 。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是 。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的 。
（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因 。
答案：
(1) 基因组文库 cDNA文库
(2) 解旋酶 加热至90-95℃ 氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
资料：刘本举：与PCR技术有关的常见问题答疑，生物学教学，2012
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