“剪裁”出的抗肿瘤细胞——CRISPR首次应用于TCR-T临床治疗
CRISPR是一类广泛存在于细菌与古菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，它充当了这些细菌防御外源遗传物质的“基因武器”，人们发现了它对DNA的编辑功能，而将其作为基因研究领域的有力的“基因编辑工具”。而近期的一项研究中，CRISPR技术首次被应用于TCR-T的临床研究当中。此次实验证明了CRISPR应用于TCR-T临床治疗的可行性，但也无法避免技术本身的短板。不过，无论如何，此次实验为细胞治疗研究领域提供了一种高效且可行的技术手段。
CRISPR技术与其在细胞治疗中的应用
CRISPR/Cas系统是我们很熟悉的基因编辑系统，目前已发现三种不同类型的 CRISPR/Cas系统，存在于大约40%和90%的细菌和古菌中。
其中原核II型的组成较为简单，也得到了广泛应用，主要由Cas9蛋白以及gDNA(向导RNA)组成。在gRNA的引导下靶向识别基因组序列，Cas9核酸蛋白酶有两个DNA酶结构域切割DNA，最终形成双链断裂损伤（double stranded break, DSBs）。DSBs通过两种DNA损伤修复机制同源重组修复机制（homology directed repair, HDR）和非同源重组末端直接连接修复机制（non-homologous end joining, NHEJ）对切割的DNA进行修复1。
图1.CRISPR 系统工作原理
CRISPR/Cas9 系统的应用非常广泛，这得益于此系统易掌握操作并且效率高。
CRISPR/Cas9 系统最集中的工作便是设计20几个碱基的gRNA，这种设计和合成难度对于有过基础分子生物学技能训练的科学工作者都非难事。而CRISPR的高效率一方面体现在工作效率远高于常用的两种基因编辑技术ZFN和TALEN，另一方面CRISPR可以同时针对多个不同的位点进行基因编辑，而只需要导入不同的gRNA 就可以完成，这是其他基因编辑技术无法轻易达到的高度。
在生物研究的任何领域几乎都能看到CRISPR的身影，同样也包括了发现抗癌新靶点、基因治疗以及在临床研究中助攻CAR-T或TCR-T的细胞治疗。
中国在CRISPR技术方面一直走的国际前列，如下表所示中国在CRISPR对CAR-T编辑进入临床阶段的研究占据了绝大部分1。在这些研究中对免疫检查点PD-1或PD-1调控基因的敲除占了2/3。当然，这些临床结果还需要和自表达PD-１抗体的Car-T或Car－T与PD－１联合用药的结果做更详尽的临床数据比对，才能得出哪种策略更适合于临床治疗，但利用CRISPR敲除PD１的策略可能更经济，更高效。
表1. 截至2020年1月，利用CRISPR技术编辑的细胞治疗进入临床研究的进展
CRISPR技术应用于TCR－T的临床研究
在这些研究中，Carl. Jun实验室于今年二月发表在Science上的文章较详细的介绍了CRISPR在TCR-T临床研究中的影响。
在为期9个月的临床研究中，CRISPR编辑过的T细胞免疫原性非常的小，也证明了CRISPR在癌症免疫治疗中的可行性。
首先我们先看看整个实验的流程和TCR-T编辑的要点。此临床试验共招募了6名难治肿瘤病人，抽取病人的血液并分离T细胞；先电转cas9 /gTRAC、 gTRBC、gPDCD1分别用于敲出T 细胞内源性的TCR基因以及PD-1的编码基因PDCD1；挑取阳性Cas9表达的阳性克隆用腺病毒载体将NY-ESO-1的TCR转入T细胞中；再次挑取NY-ESO-1 TCR阳性表达的细胞系扩增表达后回输病人体内2，如图 23。
图2. 整个NYCE T 细胞治疗过程以及CRISPR-Cas9 编辑的NYCE T细胞
其中NY-ESO-1是一种常见于多种侵袭性肿瘤中的癌症相关蛋白，是全身最具免疫原性的抗原之一。它在包括乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、NSCLC、肝细胞癌以及卵巢癌在内的多种癌症中广泛表达，表达范围为20-80％，除了胎盘，睾丸中外在正常组织中几乎不表达因此，被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。但是由于NY-ESO-1是肿瘤细胞内抗原，非膜抗原，CAR-T无法对其进行识别。但是TCR-T则不同，只要能被HLA提呈的抗原都可以被识别，包括细胞内和细胞膜上的抗原，针对NY-ESO-1 ，TCR-T展现出独特的优势，而且一般情况下正常组织不表达肿瘤胞内抗原，TCR-T进行治疗也不用考虑脱靶引起的安全问题。
在整个过程中有2位病人的T 细胞未能完成基因编辑，另有1位病人病程进展太快未能完成整个治疗过程。最终临床结果采集了3个病人的结果，其中一位病人UPN07病情没有改善；另2位病人中有一位病人UPN35治疗效果明显，治疗了9个多月并且现在临床数据还在采集中；病人UPN39经过4个月的治疗存活了下来（图3-A），肿瘤也明显缩小，如图3-B所示，并且这3个病例免疫原性也很弱。这些结果都显示NYCE T 细胞治疗具有较好的效果。
图3. NYCE T细胞治疗在临床上的应用结果
虽然在临床上已经看到较为明显的结果，但是在这个过程中CRISPR技术起到多大的作用？以及一直被诟病的CRISPR的脱靶问题是否也在此次的研究中带来很多的困扰？针对这些问题在这篇文章中也进行了较为深入的探讨。
1 .CRISPR-Cas9 的敲除效率以及持续工作能力
虽然在筛选阳性克隆的时候无论是基因还是蛋白水平都可以检测到Case9的表达，但是三个基因的gRNA 引导的基因敲除效率不同，同时敲出三个基因的效率更低。利用单细胞测序的方法共检测了43个细胞，同时三个基因都敲出的细胞只有6个，如图4-A所示。在临床观察中，随着时间的推移三个突变基因表达量下降较多（图4-B）；三个基因都突变的T细胞也在近4个月的时间逐步丢失，无论是NY-ESO-1 TCR-或NY-ESO TCR+中这种情况都有发生，如图4-C所示。由此都可以看出CRISPR的工作效率似乎没有想象中那么堪以重任，但是这一结论还需要更多的实验数据。
图4.CRISPR-Cas 9的敲出效率以及持续能力检测
2.CRISPR的脱靶和染色体重组效应
为了检测CRISPR在这次实验中是否有脱靶现象，是否造成严重的影响，作者利用iGUIDE技术检测TRAC gRNA+Cas, TRBC gRNA+Cas, PDCD1 gRNA+Cas9不同阳性T 细胞中被剪切的基因。发现不同的gRNA 介导的剪切都存在一定的脱靶。如TRAC gRNA 除了剪切TRAC，CLIC2也检测到较多拷贝；TRBC gRNA除了剪切TRBC，ZNF609同样检测到较多（图5-A），虽然这两个基因都未有报道有很重要的作用，但是不能说明CRISPR的脱靶效应不会产生严重的影响。除了脱靶现象，实际上，在细胞和临床检测上都发现了染色体的重组，但所幸的是这种重组经过一段时间后，逐渐消失并未产生影响（图５－B）。
图 5. CRISPR脱靶效应和染色体效应检测。
CRISPR技术已经在很多方面得到了应用，同样做出了很多杰出的工作，但用于编辑TCR-T并应用到临床还是第一次。
作者用CRISPR一共敲除了3个基因：TRAC、TRBC、PDCD1。尽管三个基因都敲除的效率并不是很高，随着病人治疗时间的持续，同时敲除了三个基因的细胞比列也变得越来越低，但是通过iGUIDE检测测序结果还是发现Cas 9阳性T细胞中 TRAC，TRBC，PDCD1基因分别具有显著的敲除。
由于病例较少，这些结果并不能特别显示CRISPR系统提高了TCR-T的作用效率，特别是与Carl. Jun实验室在15年利用TCR-T针对抗原NY-ESO-1和LAGE-1治疗多发性骨髓瘤结果相比，似乎很难得出CRISPR提高了TCR-T的工作效率。在15年Carl. Jun实验室发表的结果中，临床I/II期的实验一共招募了20个病人，其中有16个病人在临床研究中有积极的响应，平均治疗生存期为19个月。这些结果都显示在没有CRISRP的作用下，针对NY-ESO-1的TCR-T依然具有很好的抗癌作用4。除此之外CRISPR的脱靶依然是后期使用这种技术需要着重考虑的问题。
但无论如何CRISPR作为高效易掌握的技术为细胞治疗提供了更多的可能性，更高的效率。这次的临床研究成果也未显示CRISPR编辑的TCR-T有明显的免疫原性，相信在不远的将来我们会看到CRISPR在细胞治疗中会应用的越来越多，也会越来越成熟。
参考文献：
1. Candice Ashmore‑Harris and Gilbert O. Fruhwirth. The clinical potential of gene editing as a tool to engineer cell-based therapeutics. Clin Trans Med 9:15 https://doi.org/10.1186/s40169-020-0268-z(2020).
2. Jennifer R. Hamilton and Jennifer A. Doudna. Knocking out barriers to engineered cell activity. Science 10.1126/science.aba9844 (2020).
3.Edward A. Stadtmauer et.al., CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer.Science 10.1126/science.aba7365 (2020).
4. Aaron P Rapoport et.al., NY-ESO-1–specific TCR–engineered T cells mediate sustained antigen-specific antitumor effects in myeloma. Nature Medicine doi:10.1038/nm.3910 (2015).
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