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【分迪看点】：表观遗传修饰酶通过调控基因表达可能会引起疾病的发生。利用 PROTAC 技术靶向降解特定表观遗传蛋白，对疾病的治疗具有重要意义。
近日，德国弗莱堡大学 Manfred Jung 课题组发表综述报道了 PROTAC 在表观遗传学中的应用，重点报道了 PROTAC 作用于表观遗传学靶标的最新进展。PROTAC 是一种异双功能分子，可利用天然的泛素-蛋白酶体途径选择性降解目标蛋白，这种新兴的技术已应用于包括（核）受体、激酶和表观遗传蛋白等多种靶标的选择性降解。目前已在表观遗传学领域设计出了许多PROTACs。
表观遗传学是一个快速发展的研究领域。过去几十年中已对三种主要的表观遗传机制（如DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA）进行了深入研究，鉴定出许多蛋白质为表观遗传修饰因子，这些遗传蛋白在基因调节、细胞信号传导以及代谢途径和致病过程中发挥重要作用。目前针对表观遗传靶标已报道了多种抑制剂且部分已被批准用于癌症治疗，但长期使用会出现耐药性问题，这些问题有望通过 PROTAC 技术得到解决。
PROTAC可利用天然的泛素蛋白酶体途径诱导目标蛋白降解，其结构可分为三个不同部分，即靶向目标蛋白质（POI）的配体，靶向 E3 泛素连接酶的配体，以及连接两个配体的Linker。这种双功能特性使 PROTAC 可以同时结合目标蛋白和 E3 连接酶并形成三元复合物（POI：PROTAC：E3），引起目标蛋白的多聚泛素化并被蛋白酶体降解（图1）。与传统基于占用的小分子抑制剂相比，PROTAC具有许多优势，例如，药效长、靶标选择性高、表型抑制率高、具有催化性、可完全抑制多结构域蛋白，且由于 PROTAC 不局限于活性位点，可以靶向任何可及的蛋白质区域，从而可实现“不可成药”蛋白质的降解。
PROTAC一词始于2001年，当时 Sakamoto 等人报道了一种基于肽的靶向降解蛋氨酸氨基肽酶-2降解剂，但由于分子量高和结构不稳定导致细胞通透性差。直到具有改善药代动力学特征的E3连接酶配体的发现，才设计了第一个全小分子的靶向雄激素受体的 PROTAC。在随后的几年中，又报道了多种靶标的高效降解剂，包括激酶、（核）受体和表观遗传学靶标，还诞生了新的 PROTAC 技术，例如dTAG系统、HaloPROTAC、phosphoPROTAC、PHOTAC和溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）。最近，人们在 PROTAC 设计、三元复合物的形成和 Linker 结构方面做出了巨大的努力，这些因素都是成功降解蛋白质的主要驱动因素。三元复合物的形成可以通过协同系数α来表征，该系数定义为二元复合物（PROTAC：POI或PROTAC：E3）和三元复合物（POI：PROTAC：E3）的解离常数之比。最近发现α > 1与高效降解能力和低 Hook 效应具有正相关性，因此通过协同系数α表征复合物的形成是可取的，但也有一些实例表明协同作用对于蛋白的有效降解不是必不可少的，且三元复合物的形成也不一定会导致蛋白降解。在2018年，Nowak等报道了几种不同PROTACs形成三元复合物的晶体结构。从复合物的晶体结构可以看出两种蛋白质的界面仅有微弱的相互作用，研究发现PROTAC的Linker长度和与复合物结合位置会影响 BRD4 和 CRBN 复合物的结合构象（图2）。进一步对不同 Linker 进行评估后发现某些特定长度和结构的 Linker 对三元复合物的形成和稳定有利，但 Linker 的设计仍然难以捉摸。因此在设计PROTAC时，除了考虑三元复合物的形成和Linker的组成外，还应考虑PROTAC稳定性、细胞的通透性、靶标丰度以及靶标的再合成速率。
迄今为止，用于 PROTAC 结构设计和预测三元复合物结构的计算方法包括：（a）将 PROTAC 分别目标蛋白和E3连接酶对接，以估计所需Linker的最小长度；（b）分子动力学研究或MELD交换模拟，以预测形成的三元复合物的结构；（c）蛋白-蛋白对接，为E3连接酶/POI复合物提供可能的模型；（d）构象取样方法，可提供合理结合构象。Drummond 和Williams 使用MOE建模软件包对 PROTAC 介导的三元复合物进行了最详细的计算机模拟。这些方法均被验证可行，但 PROTAC/CRBN/BRD4 复合物的结构预测远不能令人满意，这可能是由于该复合物中蛋白之间的相互作用较弱。
不同类型的表观遗传酶会通过修饰基因表达和蛋白功能促进不同的细胞过程和发病机制，例如“写入酶”（Writers）可将化学基团连接到组蛋白和非组蛋白的特定氨基酸残基上，“擦除酶”（Erasers）通过切断表观遗传修饰来逆转此反应，“读取酶”（Readers）（如转录因子）会特异性识别修饰的残基，并将蛋白质引导至特定的修饰区域。目前三种表观遗传蛋白均有相关的PROTAC设计（图3）。图3 表观遗传靶标(Readers、Erasers和Writers)的PROTACs
表观遗传学领域的大多数PROTAC研究都是关于Reader蛋白BRD4（BET蛋白的成员），BET家族主要通过识别组蛋白和非组蛋白的乙酰化赖氨酸残基来使这些蛋白与靶标特异性结合。由于BRD4会导致癌症和炎性疾病，近年来已经报道了多个BET蛋白抑制剂，但较差的选择性限制了其临床运用。BRD4是第一个运用化学诱导蛋白降解的表观遗传蛋白。三个研究小组报告了三个不同的靶向BRD4的PROTACs（dBET1、ARV-825和MZ1），它们在亚微摩尔范围内显示相似的降解效果且都依赖于JQ1作为结合BRD4的配体结构，但Linker的设计和募集的E3连接酶有所不同。dBET1、ARV-825均靶向CRBN，MZ1靶向VHL，但dBET1选择性较差。在最近几年中，进一步优化了针对 BRD4 的 PROTAC，使其具有更高的选择性和降解能力，例如QCA570有效降解浓度已经低至皮摩尔范围，并可显著的抑制癌细胞的生长。BRD9在Reader蛋白质组中研究较少，除了作为自整合障碍因子（BAF）复合物（SWF/SNI复合物）的组成部分以外，其功能尚不完全清楚。先进的 BRD9 降解剂可显着抑制不同癌细胞系的增殖。Zoppi 等人基于修饰的BRD9/7抑制剂和VHL的配体合成 BRD7和BRD9 的纳摩尔高效双重降解剂。染色质相关的Reader蛋白 TRIM24 是TRIM/RBCC家族的一员，是一种重要的转录调控因子。高水平的 TRIM24 与癌症有关，但 TRIM24 抑制剂不能对癌细胞产生影响。有趣的是，基于TRIM24 抑制剂IACS-9571和VHL配体设计的靶向 TRIM24 的 PROTAC 却可有效抑制急性白血病细胞的增殖。已发布用于降解SMARCA2 / 4的双重PROTAC（ACBI1），SMARCA2 / 4是含溴结构域的蛋白质BAF 复合物的重要成员。Ciulli 研究小组使用基于结构的方法来优化其降解分子，该降解分子由SMARCA 溴结构域抑制剂和 VHL 配体组成。与SMARCA抑制剂作用相反，PROTAC 能够再现敲除实验的表型效应，因此，可以促进对癌细胞中 SMARCA 和 BAF 功能的研究。图 表观遗传学的Writer、Reader和Eraser(图片来自网络）
迄今为止，Eraser蛋白质组中仅开发了针对组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）的PROTAC。HDAC在调节染色质结构、转录因子和非组蛋白功能方面具有重要的作用。在过去的几十年中，已经发现了有效的HDAC抑制剂，其中五种已经被批准用作治疗药物。然而，这些抑制剂中的大多数都是非选择性的，会导致脱靶毒性和副作用。
2017年，研究者小组将PROTAC技术应用于Sirtuin2（Sirt2），Sirt2是NADþ依赖的III类HDAC的成员，可参与多种细胞过程，包括转录、信号传导、代谢途径、衰老、细胞凋亡和炎症。Sirt2-PROTAC由基于SirReal Sirt2选择性的配体和基于沙利度胺的CRBN募集配体组成。与 SirReal 抑制剂的酶促抑制作用相比，Sirt2-PROTAC可实现Hela细胞中Sirt2的同种型选择性降解和更显著的微管蛋白乙酰化。锌依赖性IIb类HDAC6主要位于细胞质中，主要通过修饰非组蛋白（例如α-微管蛋白和HSP90）来参与细胞运动和免疫调节。Yang等人于2018年首次报道了HDAC6的靶向降解。出乎意料的是，使用泛HDAC抑制剂作为PROTAC的靶蛋白结合配体可实现癌细胞中HDAC6的选择性降解，这再次强调了三元复合物的稳定性对于目标蛋白选择性降解的重要性。
p300/CBP相关因子（PCAF）和组蛋白乙酰化修饰关键因子GCN5是具有乙酰转移酶结构域和溴结构域的多结构域蛋白。这些蛋白质在DNA损伤修复、细胞增殖和分化以及代谢和免疫途径方面均有重要的作用。已报道的抑制剂对PCAF/GCN5溴结构域的抑制作用不足以模拟巨噬细胞和树突状细胞中蛋白水平下降的影响，并且无法对细胞中的这些蛋白质进行功能分析。Tough小组正在通过开发靶向溴结构域的PCAF/GCN5降解物（GSK983）的来解决此问题。他们将PCAF/GCN5抑制剂GSK4027与CRBN的配体结合在一起实现了纳摩尔范围内实现了PCAF/GCN5的高效降解。此外，他们发现用小分子抑制剂抑制溴结构域不足以对单核细胞的分化产生影响，而是需要使用PROTACs完全降解蛋白质。
尽管PROTAC技术最近几年取得了显着进步，但仍面临很多问题。理论上应继续研究Linker和三元复合物的结构，进一步阐明复合物中的蛋白质相互作用以及更好地评估Linker在药效和药代动力学方面的作用。迄今为止，可利用的E3连接酶也非常有限，E3连接酶的扩展也可能导致产生新选择性的PROTAC。目前已在表观遗传学领域设计了许多PROTACs，进一步研究表观遗传蛋在疾病中的功能有利于发现潜在候选药物。参考文献
https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2020.01.010
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