查看原文
其他

紫薯博士专栏 | 靶向JAK-STAT信号通路在炎性和自身免疫及新冠肺炎治疗中的开发应用

紫薯博士 药时代 2021-12-12

前FDA专家为您解读中国药企的三大重磅机遇!全球申报、真实世界证据、供应链空白。价值不菲!不要错过!

⬆️ 扫描二维码,参加重磅直播!



最近,制药界最引人注目且最大的药品转让莫过于为了清除百时美施贵宝收购新基潜在的反垄断交易障碍,安进以134亿美元高价收购新基的银屑病重磅药物Otezla。是什么研发管线有如此巨大的潜能,吸引了证监会的高度关注呢?原来是BMS的在研新药TYK2小分子激酶抑制剂,JAK家族曾经最不起眼的成员。它真的有成为重磅药物的潜力,值得吸睛无数吗?

同时,欧美新冠疫情持续恶化,新增患者数量居高不下。而靶向JAK/STAT通路到底能否解决新冠危重患者的细胞因子风暴难题?

2017年小结JAK/STAT通路时,还没有重磅药物产生,现在已经有了两个,接下来JAK靶点还能产几个重磅药物呢?

本文更新一下JAK/STAT信号通路的最新研发动态及在抗新冠病毒中可能的应用。


JAK-STAT信号通路简介


JAK-STAT通路主要由4个部分组成:(1)胞外信号因子(2)受体(3)JAK激酶(4)信号转导及转录激活蛋白(STAT)。JAK-STAT是除了第二信使系统外最重要的信号途径。

胞外信号:包括干扰素、白细胞介素、生长因子等等,总共有超过60种细胞因子参与JAK/STAT信号传导。

受体:JAK-STAT通路相关受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性,而是通过胞内结构域与JAK激酶结合,进一步激活下游的STATs,以实现信号从胞外到胞内再到细胞核的转递。

JAK激酶:JAK激酶家族的蛋白共有4个,包括JAK1、JAK2、JAK3、TYK2

JAK激酶主要由4个结构域组成,包括N端FERM与SH2样(Src Homology 2)结构域,一起构成主要的受体结合部分。其次是假性激酶结构域JH2(JAK Homology 2)和C端酪氨酸激酶结构域JH1(JAK Homology 1 )。

JH2是JAK的最典型特征之一,在其它激酶中较少出现。它与经典的蛋白激酶具有序列同源性,但缺少了关键的催化残基。JH2在没有细胞因子刺激的情况下,能够抑制JAK活性,而在细胞因子诱导时具有激活、调控信号传导的作用。JH2是引起免疫和肿瘤疾病的突变突变区域。最典型的例子就是JAK2 V617F突变,是导致骨髓增生性肿瘤(MPN)发生的主要因素。

大部分激酶小分子抑制剂均作用于JH1激酶结构域,最大的问题就是选择性较低。而由于JH2在不同的JAK家族中差异大,BMS作用于JH2的小分子抑制剂的选择性是迄今为止最好的。

Domain structure of JAK2 protein and model of its activation

不同的受体结合选择不同的JAK蛋白。其选择特异性也各不相同。比如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21等通过共用的γ-链(γ-chain,γc),只特异性地结合JAK3,来传递信号。其它的受体亚基能够通过与不同的JAK结合来传递信号,如gp130亚基能够结合JAK1、JAK2和TYK2。

进一层的选择性则由受体亚基的配对来决定,如γc受体亚基只与JAK1结合的受体亚基选择配对。JAK2相关的生长因子和激素类细胞因子受体则具有独特的自配对属性。

从功能获得性(gain of function)表达或突变分析来看,JAK1、JAK3及TYK2更多与免疫调节有关,JAK2则与红细胞和血小板的异常增多引起的血液癌症直接相关。

Impact of inhibiting various JAKs on signaling by different cytokines

信号转导及转录激活蛋白STAT:人体中有7种STAT基因,即STAT1、2、3、4、5A、5B、6。

JAK激酶通过结合受体感受胞外的信号,并将信息传送到STATs。磷酸化的STATs能够从胞内转移到细胞核,而每种不同的STAT结合到各不相同的启动子DNA序列上。启动子会控制其DNA序列表达,引起DNA转录与活性水平发生改变,进而影响细胞生长、分化及死亡等基本细胞功能。

不同的STAT主管的功能既有重复又不尽相同。如STAT1主要与IFNγ介导的病毒和癌症免疫直接相关。

靶向JAK的药物开发如火如荼,而靶向STAT的进展却是雷声大,雨点无,迄今还不见结果,而在不久的将来也还没有见到曙光。

Overview of JAK–STAT signaling in host defense and cellular homeostasis


炎性自身免疫性疾病与JAK小分子激酶抑制剂的开发


炎性疾病和自身免疫性疾病是慢性疾病,其发病受到遗传和环境因素的多重影响。细胞因子在炎症性疾病的发病机理中起着至关重要的作用,每种炎症均具有典型的细胞因子图谱。

不同的T细胞亚型在疾病的发生时被特定的细胞因子激活,而在疾病进展过程中又会通过不断产生新细胞因子来进一步驱动炎症恶化。同时,淋巴和髓样细胞的网络也会不断增砖添瓦,产生更多细胞因子,使炎症更加复杂化。

例如,自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞会分泌促炎细胞因子,吸引并激活其他免疫细胞,而髓样细胞(包括树突状细胞)可能会诱导I型干扰素(IFN)过度生产,从而导致B细胞产生抗体。

靶向细胞因子的抗体或生物制剂连年爆棚,是炎症与自身免疫药物研发最热的方向。而多数细胞因子是通过JAK-STAT信号途径完成功能使命的,这也为直接靶向JAK提供了有力的理论依据。

Cytokines implicated in pathogenesis and biologic drugs in autoimmune and inflammatory diseases

JAKinibs(JAK小分子激酶抑制剂)的故事始于NIH的免疫学家John O'Shea于1994年发现JAK3作为淋巴细胞的关键调节剂和辉瑞的Tofacitinib的研发历程。Tofacitinib在疗效和安全性方面的积极结果刺激了其它几种针对不同JAK的药物开发,而体细胞JAK2激活突变的鉴定进一步刺激了JAK的开发活动,特别是在血癌方面的应用。

目前,三种JAK抑制剂Tofacitinib、Baricitinib和Ruxolitinib已在美国和欧洲批准用于临床。这些药物都代表了第一代具有竞争性的三磷酸腺苷(ATP)的JAKinibs,并以主动构象靶向JH1酪氨酸激酶域。选择性更高的JAKinibs也陆续获得FDA批准,包括JAK2抑制剂Fedratinib、JAK1抑制剂Updacitinib。

这里,我们按照靶向不同JAK的应用介绍相关药物研发的最新进展。


靶向JAK3治疗自身免疫疾病


JAK3在造血细胞中特异性表达,是白细胞介素IL-2、4、7、9、15和21等信号通路的关键组成部分,与常见的γc受体结合,驱动T细胞、B细胞、NK细胞等的发育、生长、增殖等功能。JAK3功能缺失会造成淋巴细胞减少,引起严重的免疫缺陷。

从NIH的免疫学家John O'Shea于1994年最早报道了JAK3作为免疫抑制剂的潜力,到与辉瑞合作开发的JAK3选择性抑制剂Tofacitinib于2012年11月获得FDA批准用于RA,历时18年。上市开始几年,Tofacitinib在细胞因子等抗体药的夹缝中艰难生存,加上有黑框标记,销售不是很理想。随着人们对其使用和毒性经验的积累,最近几年,Tofacitinib的销售潜力有所改观,也间接促进了其它JAK小分子激酶抑制剂在自身免疫疾病的开发。

2017年Tofacitinib的年销售达到重磅,为13亿美元,而2019年增长到22亿美元。分析师预期这可能接近Tofacitinib的销售峰值了。辉瑞对Tofacitinib的销售增长则更为乐观。

Tofacitinib年销售增长及预期Tofacitinib年销售在RA上占比

选择性靶向JAK3的小分子非常难做。Tofacitinib对于JAK1JAK2的选择窗口也不高。其它的两个JAK3抑制剂开发也不是非常积极,包括Decernotinib (VX-509)、Pefcitinib(ASP015K)等。

辉瑞最近通过基于结构设计开发了选择性极高的共价不可逆的JAK3抑制剂PF-06651600(对其它JAK选择性超过百倍),通过JAK3 JH1 ATP口袋中的非保守半胱氨酸(Cys909)起作用。

PF-06651600目前处于2期临床开发,适应症主要针对RA、CD、UC和AA。PF-06651600的高选择性能否转化为临床获益,特别是有更小的副作用,有待观察。


靶向JAK1治疗自身免疫疾病


JAK1在多种信号通路中起作用,通过共同结合不同受体与其它JAK蛋白家族有着紧密的联系,如通过IFN-γ受体与JAK2,通过γ链(γc)受体(通过IL-2、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21)与JAK3,通过IFN-α/β受体及IL-10家族的受体与TYK2直接发生相互作用。JAK1还与JAK2和TYK2配对通过含糖蛋白(gp)130的受体传递信号(IL-6、IL-11和IL-27)。所以,看起来使用JAK1选择性抑制剂似乎不比JAK3选择性抑制剂在安全性上更好。但JAK1更有优势的一点在于选择性的抑制剂更容易得到,可以有效避免JAK2依赖促红细胞生成素(EPO)和血小板生成素(TPO)途径引起的不良反应如贫血、中性粒细胞减少和血小板减少等毒性。

吉利德的Filgotinib(GLPG0634)是第一个进入人体临床试验的JAK1选择性抑制剂。Filgotinib在体外酶活性分析显示对JAK2的选择性只有3倍,但在全血检测中有约30倍的选择性。相比起来,艾伯维的Upadacitinib似乎选择性好更多。这两个JAK1的选择性抑制剂在自身免疫如RA等临床上均表现出良好的疗效以及可控的毒性,因此均被各自公司视为重磅。特别是Upadacitinib被艾伯维寄予厚望,与其IL-23的抗体Risankizumab一起,拉起“后修乐美时代”的大旗。

而吉利德对Filgotinib的推进也是不遗余力,为了加速审批,于2019年12月递交NDA时用了一张优先审批卷。

其它的JAK1选择性抑制剂还包括Incyte的Itacitinib(INCB039110)、GSK的Solcitinib(GSK2586184)、辉瑞的PF-04965842,均已经开展二期临床。而礼来的JAK1/JAK2的抑制剂Baricitinib历尽周折,已经获得FDA批准用于RA。但由于起较高的毒副作用,大家对其销售前景并不乐观。但Baricitinib在2019获批后的第一年销售达到4.3亿美元,成为小重磅好像也不难。



靶向JAK2或JAK1/JAK2治疗血液癌症


JAK2 V617F突变在骨髓增生性肿瘤(MPN)中普遍存在的发现极大地促进了JAK2抑制剂的开发。

MPN是一种以骨髓中异常造血祖细胞增殖为特征的慢性疾病。MPN包括骨髓纤维化(myelofibrosis,MF)、真性红细胞增多症(polycythemia vera,PCV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia ,ET)和慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia ,CML)。

大约95%的PCV患者,和50-60%的MF和ET患者都被发现有JAK2 V617F单氨基酸突变。这个突变发生在假性的JH2激酶区域,引起了JAK2整体构象改变,造成了不依赖胞外细胞因子信号的JH1激酶区域的持续激活,进而引起血液癌症 。

Ruxolitinib由Incyte与诺华联合开发,是一个JAK1/JAK2小分子激酶抑制剂,于2011年11月获得FDA批准,用于治疗中、高危的骨髓纤维化MF。Ruxolitinib能够缓解JAK2 V617F 突变引起的脾脏增大(Splenomegaly),减轻患者虚弱的症状但不能够减少变异血癌细胞的JAK2 V617F突变负荷(allele burden)。

Ruxolitinib的毒副作用主要包括贫血、血小板减少症、中性粒细胞减少症和腹泻等,多为JAK1/JAK2直接靶向相关毒性。

在2017年的小结文章中还在抱怨Sanofi开发的高选择性的JAK2抑制剂Fedratinib显示出高疗效,却也有“高”毒性——韦尼克脑病(encephalopathy),于2013年底被FDA迅速叫停了相关的临床试验。完全不曾想被拾荒王John Hood变废为宝,挽救了Fedratinib,说服FDA脑部相关毒性是可控可防的,得以重启Fedratinib的临床试验,而此时新基以11亿美元首付,最高达70亿美元收购了John Hood的Impact Biomedicines。在没有开展新的临床实验的情况下, Fedratinib于2019年8月16日顺利获得FDA的批准,成就了一番淘宝传奇。

Ruxolitinib在2019年的销售额达到28亿美元,包括了其在移植物抗宿主病(graft vs host disease,GVHD)上的收入,轻松超过重磅的标准,而且销售还在快速增长中。

新基预测Fedratinib的销售峰值可达10亿美元的重磅标准,但许多分析师的预期要少于重磅。这要看Fedratinib的疗效与毒性窗口在临床应用中的真实表现,到底比Ruxolitinib好多少,这里暂不把它列为重磅。

JAK small molecule kinase inhibitors

图片中的缩写及其对应的全称:AA=alopecia areata;AD=atopic dermatitis;AS=ankylosing spondylitis;CD=Crohn’s disease;RA=rheumatoid arthritis;SLE=systemic lupus erythematosus;UC=ulcerative colitis。


靶向TYK2治疗自身免疫疾病


TYK2曾经主要被认为仅仅调控IFN-α途径,尽管TYK2-/-小鼠表现出IFN-α/β信号转导降低,但并未完全消除。然而,TYK2的生物学功能似乎在人中要比在老鼠中更广泛。除了参与传统的IFN-α、IL-12和IL-23信号传导,新的临床数据显示TYK2也参与IFN-γ、IL-6和IL-10的信号调控。抗体疗法靶向IL-12/IL-23、IFN-α和IL-6的巨大成功刺激了TYK2作为有效靶点的无限遐想。这直接导致了BMS收购新基后被迫出售具有垄断嫌疑的重磅药物PD4抑制剂Otezla给了安进。

选择性的TYK2激酶小分子抑制剂包括辉瑞的PF-06700841,可抑制JAK1/TYK2。但具体选择性窗口还未有报道。该款药物目前正在2期临床,用于治疗CD、UC、AA和斑块状牛皮癣。

当然最有潜力的TYK2抑制剂就是BMS的BMS-986165。它的发现也事出偶然。前面提到JAK激酶家族的独特性之一即是它们有一个起调控作用的假性JH2激酶结构域。与作用于活性激酶结构域JH1不同,作用于假性激酶结构域的药理抑制及稳定作用的机理尚未完全了解。BMS使用化合物库筛选IL23激活的转录分析时发现活性小分子具有选择性的激酶抑制活性,主要靶向JAK1的JH2和IKK。但该小分子并不抑制JAK1介导的IL-15受体信号传导。进一步的化合物优化得到候选化合物BMS-986165,阴差阳错地发现其对TYK2的JH2假性激酶结构域具有极高选择活性,达到20pM。而临床前的小鼠模型也在SLE和IBD显示出良好的活性。

最近发表的应用于中度至重度牛皮癣包括267例患者的II期研究表明,BMS-986165每日3mg或更高剂量显示良好的临床药效。最常见的不良事件包括鼻咽炎、头痛、腹泻,与安慰剂相比,接受药物治疗的患者恶心和上呼吸道感染的发生率更高(积极治疗组为55–80%,而安慰剂组51%)。需要持续时间更长的临床试验来确认安全性和耐用性临床效果。目前,该化合物已进入SLE和CD的2期试验,以及3期中度至重度银屑病的试验。分析师乐观地认为其具有重磅潜力。


靶向JAK治疗自身免疫疾病的毒副作用


超过57种细胞因子可能会受到第一代JAKinibs的影响,而大多数不良事件可以通过细胞因子的已知作用机理来解释,但也有一些难以解释的毒性。

感染风险
考虑到JAKinibs阻断的大量细胞因子,感染风险似乎没有预期的严重。一种解释可能是许多细胞因子,例如TNF、IL-1、IL-8和IL-17等不依赖于JAK/STAT信号通路。

水痘带状疱疹病毒的再活化是JAKinibs治疗患者中最常见的感染性并发症之一,发生率是生物制剂患者的两倍。建议在开始用Tofacitinib或其它JAKinibs治疗之前,先给患者接种带状疱疹疫苗。

淋巴细胞减少和血液学改变
JAKinibs治疗可引起贫血、淋巴细胞、NK细胞、中性粒细胞和血小板的数量下降。由于细胞因子在造血和淋巴细胞增多中的重要性,这些副作用可被视为与靶向JAK2(例如EPO、TPO)和其他造血生长因子(例如IL-6和IL-11)的细胞因子抑制信号传导有关。尚未报道淋巴细胞和中性粒细胞的变化与严重感染或恶性肿瘤有关。

血栓栓塞事件
主要在使用Baricitinib时发生,引起了人们对血栓栓塞事件风险增加的担忧。具体原因不是很明确。

血脂异常
JAKinibs的使用与总胆固醇低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)颗粒的增加有关。尽管靶向IL-6也与高脂血症有关,但这种副作用的确切机制也尚不清楚。

肝功能和其他代谢改变
观察到肌酸磷酸激酶水平的轻度升高,这与明显的肌肉疾病无关。

恶性肿瘤
尽管JAKinibs可以用于治疗血液癌症,但在使用这些药物治疗的过程中,研究发现有些患者会罹患淋巴瘤和其它恶性肿瘤。RA患者通常会增加癌症(包括淋巴瘤)的发病率,而接受JAKinibs治疗的患者的癌症发生率与接受生物大分子疗法的患者相似。

鉴于包括IFN-r在内的细胞因子在控制癌症中的重要性,JAK抑制作用可能与癌症风险增加有关,这无疑是合理的。

JAK usage and putative relationship to adverse events


开发JAK小分子适应症的发展方向浅析


总体来讲,JAKinibs的研发已经非常拥挤。未来可提高的空间已经不多。下面几点也许还有改善空间。

进一步提高选择性
前3个获得FDA批准的JAKinibs包括Ruxolitinib、Tofacitinib、Baricitinib的选择性相对较低。而最新获批或正在NDA的新一代,特别是JAK2的Fedratinib、JAK1的Filgotinib和Upadacitinib,以及TYK2的在研小分子BMS-986165等选择性则要高很多。高选择性的JAKinibs在保持疗效的同时,能够有效降低毒副作用,是未来药化优化的方向和趋势。

减药控毒的尝试
整体来看,JAK抑制剂的毒性偏大。FDA已经批准的5个JAK激酶小分子抑制剂中,有4个有黑框警告。如何有效控制JAK小分子抑制剂的毒性,一直是药研和临床上的难题。即使是高选择性的JAK小分子,由于JAK之间错综复杂的相互联系,毒性仍旧偏高。Tofacitinib在用于溃疡性结肠炎的实践,也许是减毒的一个有效尝试。

Tofatinib以每天两次10毫克的初始治疗,然后减量为每天两次5毫克的维持治疗。这种方法在严重威胁生命的自身免疫疾病的治疗中可能对毒性控制特别有用。

个性化用药
随着我们对细胞因子信号转导和基因表达的了解不断深入,应该可以使用多种生物标志物来指导治疗,但是这一领域的成熟程度及接受度远不如所期望的。原理上讲,对JAKinibs的临床反应失败可能意味着剂量不足或该疾病不是由JAK依赖性细胞因子介导的,通过对生物标志物的筛查,理论上能够更有效的对症用药。

不同给药途径
口服全身给药是目前批准的几乎所有激酶小分子抑制剂的的标准给药方式。但对于某些自身免疫性疾病,局部集中剂量给药也有不少机会,如皮肤病、秃顶的局部治疗、肺部疾病(例如哮喘)的吸入治疗以及IBD难吸收药物的临床试验正在测试中,且初步结果非常积极。

拓展应用范围
JAKinibs在各种不同炎症及自身免疫疾病几乎均起作用,针对其开发的适应症也已非常多变。如何适用到更广阔的领域,如广谱型的抗细胞因子风暴,也许是其新的发展方向。


靶向JAK/STAT信号途径在新冠药研中的应用


2020年4月初,Incyte与诺华决定启动3期临床试验,测试Ruxolitinib在治疗COVID-19重症患者出现细胞因子风暴的疗效。细胞因子风暴是危及晚期COVID-19重症患者生命的主要因素之一。有效控制细胞因子风暴也许能够让患者更快恢复,减少重症监护的时间,特别是降低由严重过敏反应引起的死亡。

从机理上看,JAK1/JAK2抑制剂Ruxolitinib是可行的。但JAK1选择性的抑制剂获益应该更好,因为疗效相当的同时,毒副作用预期会少。但还没见有JAK1 选择性抑制剂开展相关临床试验。主要原因也许是JAK1选择性抑制剂出现相对较新,对其使用还不够熟悉。

而比JAK1抑制剂更好的选择应该是IL-6的抑制剂。IL-6是JAK/STAT信号通路中重要细胞因子,通过直接抑制IL-6在治疗CAR-T引起的细胞因子风暴中效果显著。罗氏的IL-6抗体Tocilizumab及再生元的Sarilumab均已经启动3期临床,检验其在COVID-19重症患者中的疗效。

抑制免疫反应是把双刃剑,毕竟患者还需要免疫反应来对抗病毒。在使用JAK1/2或IL-6抑制剂之前确认危重患者的确有细胞因子风暴,因症用药,效果应该更好。

重磅或具备重磅潜力的JAK抑制剂


小结


靶向JAK/STAT信号通路,特别是与之相关的细胞因子,在RA及其它自身免疫疾病是大分子药物蛋白及抗体的天下。JAK激酶小分子要做的是虎口夺食。如果要设一个小目标,那么现实就是先实现RA市场占比的10%,这也意味着400亿美元的销售,而Tofacitinib才完成了一半的任务就触顶了。还需要两个小重磅来实现目标。

JAK激酶小分子的优势是口服方便,能够克服某些大分子耐药问题,将来占据一席之地不难,但想更近一步,则需要在选择性及降低毒副作用上多下功夫。

不久的将来,JAK小分子抑制剂的重磅药物数量应该是大于等于6。

参考文献:
1、A road map for those who don't know JAK-STAT. Aaronson DS, Horvath CM. Science. 2002, 296 (5573): 1653–5.
2、The promise of Janus kinase inhibitors in the treatment of hematological malignancies. Senkevitch E, Durum S. Cytokine. 2017 Oct;98:33-41.
3、JAK-STAT Signaling as a Target for Inflammatory and Autoimmune Diseases: Current and Future Prospects. Banerjee S, Biehl A, Gadina M, Hasni S, Schwartz DM. Drugs. 2017 Apr;77(5):521-546.
4、The emerging safety profile of JAK inhibitors in rheumatic disease. Winthrop KL. Nat Rev Rheumatol. 2017 May;13(5):320. doi: 10.1038/nrrheum.2017.51.
5、Jakinibs: A New Class of Kinase Inhibitors in Cancer and Autoimmune Disease. Apostolos Kontzias, Alexander Kotlyar, Arian Laurence, Paul Changelian, and John J. O’Shea. Curr Opin Pharmacol. 2012 Aug; 12(4): 464–470.
6、Selective Janus kinase inhibitors come of age. John J. O’Shea & Massimo Gadina. Nature Reviews Rheumatology. 2019, volume 15, pages74–75
7、Selective JAKinibs: Prospects in Inflammatory and Autoimmune Diseases. Anniina T. Virtanen, Teemu Haikarainen, Juuli Raivola & Olli Silvennoinen. 2019, BioDrugs volume 33, 15–32.
8、Janus kinases to jakinibs: from basic insights to clinical practice. Massimo Gadina. et al.  2019, Rheumatology, 58, Issue Supplement_1, Pages i4–i16.




紫薯博士专栏
1、紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结
2、紫薯博士专栏 | FDA批准的52个小分子激酶抑制剂汇总及耐药机制和研发新挑战
3、紫薯博士专栏 | 膀胱癌免疫、靶向疗法最新进展
4、紫薯博士专栏 | 重磅突破!靶向RAS小分子药物最新进展
5、紫薯博士专栏 | Bcl-2抑制剂,靶向疗法的未来——可中断给药,有更多治愈

点击最下方阅读原文欣赏紫薯博士专栏全部作品!



戳“阅读原文”一起来充电吧!
: . Video Mini Program Like ,轻点两下取消赞 Wow ,轻点两下取消在看

您可能也对以下帖子感兴趣

文章有问题?点此查看未经处理的缓存