见过小分子共价药物，见过蛋白共价药物么？

导读

今天给大家介绍一篇刚刚发在《cell》上的一篇文章，文章的通讯作者是来自于中国科学院理化技术研究所杭州研究院的王谦研究员、中山大学附属第八医院的徐洋教授和来自加州大学旧金山分校的王磊教授。其中主要通讯作者王磊教授主要是利用基因密码子拓展技术研究化学生物学以及合成生物学的内容。本篇文章属于蛋白药物里程碑式的突破，成功开发了共价蛋白药物的策略。
之前在设计小分子抑制剂的过程中，要避免设计小分子抑制剂的结构可与靶点共价结合的情况，一个重要的原因是脱靶的不可控性。但近年来发现共价小分子药物由于其各种优良的性质，比如提高了药代动力学性质和治疗指数，减少了治疗剂量和给药频率，使靶点完全失活等优势使得共价的小分子抑制剂重获新生。迄今为止，市场上近30%的靶向酶药物通过共价机制发挥作用，比如目前较为熟知的阿司匹林以及第二、三代的非小细胞肺癌药物阿法替尼和奥希替尼等等。

共价小分子药物

相比较蓬勃发展的共价小分子药物，蛋白质共价药物很少有人触及。为什么？首先是由自然界蛋白质的性质决定的，蛋白质之间主要通过非共价键相互作用。其次就是氨基酸，自然界不存在可相互作用可生成共价键的两种氨基酸，且氨基酸在细胞内广泛的存在，无法实现选择性。

文章思路

PERx共价蛋白药物的开发策略

针对小分子共价药物的优点以及缺点（脱靶），理论上都可以在共价蛋白药物中得以继承和克服，因为蛋白质具有更大的作用区域，而且通常比小分子对靶点具有更高的特异性。为了能够产生可体内使用的共价蛋白药物，作者开发了一种可发生临近反应的新策略，即在蛋白药物中引入一种非天然氨基酸FSY，其可与天然氨基酸-组氨酸，通过临近反应生成共价键，从而使蛋白药物与靶点共价交联。而且这种反应不仅可以使蛋白质的化学反应具有生物相容性而且能保持对目标靶点的高度特异性（命名为PERx药物）。

验证概念模型1：PD-1和PD-L1

PD-1与PD-L1的作用模式以及抑制策略

我们都知道，PD-1是T细胞表面的一种跨膜受体，有助于控制身体的免疫反应。PD-L1是一种在许多癌细胞上发现的PD-1的配体。当PD-1与PD-L1结合时，它会阻止T细胞杀死癌细胞。PD-1和PD-L1抑制剂阻止PD-1和PD-L1蛋白相互连接，这使得T细胞能够杀死癌细胞。针对此机理，研发出了我们所熟知的O药、K药和T药，它们分别是BMS的PD-1单抗Opdivo（Nivolumab）、MSD的PD-1单抗Keytruda（Pembrolizumab）、罗氏的PD-L1单抗Tecentriq（Atezolizumab），都起到了阻断PD-1/PD-L1相互作用，让T细胞再一次活起来。但是抗体药物也有一些局限性，比如组织和肿瘤渗透性差、Fc效应耗竭免疫细胞和诱导组织损伤等。

PERx共价蛋白药物的作用模式

基于此背景，作者为了验证上面提到的PERx共价蛋白药物可用于治疗的策略。作者利用非天然氨基酸技术将FSY定点插入到PD-1的胞外区域，体内和体外实验均证明了含有此非天然氨基酸的PD-1蛋白可特异性的与肿瘤细胞的PD-L1结合。与野生型的PD-1蛋白相比，插入FSY的PD-1蛋白可显著增强人T细胞和CAR-T细胞的活性，强力抑制肿瘤生长。抗肿瘤效果与anti-PD-L1（Atezolizumab）抗体相当或者更高，证实了通过此策略得到的共价蛋白质药物的治疗效果优于传统非共价的蛋白质药物。

共价结合PD-L1后抑制肿瘤活性数据

验证概念模型2：dZHER2和HER2

开发针对HER2靶点的共价蛋白药物策略

在验证了免疫治疗的效果之后，作者想继续通过此临近反应的策略开发其他潜在共价蛋白质药物，他们使用亲合体dZHER2（来源于葡萄球菌A蛋白）对乳腺癌细胞HER2受体的高亲和力，通过晶体结构，在dZHER2和HER2结合处D37位点定点引入FSY，通过与HER2的H490处的组氨酸特异性共价结合。下图中可见针对dZHER2（36FSY）和dZHER2（37FSY）均检测到dZHER2与HER2结合的共价复合物，但未检测到野生型dZHER2和HER2的交联带。再一次证明了利用天然蛋白-蛋白相互作可以开发共价蛋白药物的可行性，使这一独特的治疗潜力将会在蛋白质上得到充分开发。

dZHER2（37FSY）与HER2共价交联胶图

优势总结

1：与抗体相比，PERx药物从人类自身蛋白出发，与临床相关表位靶点结合，而不是抗体识别的随机表位。此外，分子量低于肾小球滤过阈值的小蛋白在体内会被迅速清除，因此不适合作为药物在体内使用，但在各种情况下，如外渗、组织渗透、肿瘤过滤和积累等情况下，它们比大抗体更受青睐。PERx现在可以将这种小蛋白生物制剂作为体内疗法。尽管半衰期不长，但是它的共价作用产生的高活性与具有长半衰期的抗体相当。PD-1(FSY)的分子量仅为15.6 kDa，大约比单克隆抗体(150 kDa)小一个数量级。在大肠杆菌中可以高表达PD-1(FSY)，重现性好，成本低，制造上优于抗体。
2：即使蛋白药物可以与多个蛋白靶点结合，但通过合理的放置非天然氨基酸与靶点残基进行选择性反应仍可实现对单一靶点的共价特异性。简而言之，PERx的共价反应需要药物-靶标结合和非天然氨基酸-天然残基配对的双重定位，从而提供独特的特异性和靶标选择性。
3：共价蛋白将具有零解离率和无限亲和力，为治疗、诊断、成像和单细胞分析提供巨大的便利(例如，不可逆结合、高灵敏度、低背景)。此外，该策略可在活细胞甚至模型动物中直接生成不可逆的蛋白结合物，选择性地抑制或激活高特异性的信号通路，为基础生物学研究和合成生物学提供新的途径。

专家点评

北京大学药学院刘涛研究员(课题组主页http://sklnbd.bjmu.edu.cn/team/liutao/LiuLab.html），北大药学院分子与细胞药理系主任，天然药物与仿生药物国家重点实验室PI，国家优青。课题组方向主要是非天然氨基酸定点修饰技术在生物医药领域的应用，其课题组一直关注于发展具有共价交联活性的非天然氨基酸（J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 41, 13253–13259），刘涛老师对此文章的独家精彩点评如下：
共价修饰蛋白靶点的小分子药物已经在制药领域取得了巨大成功，然而共价修饰蛋白靶点的蛋白药物却是让人脑洞大开。既然非天然氨基酸技术可以实现蛋白质的定点修饰，为什么之前不能研发出共价修饰蛋白的蛋白药物呢？首先对于反应活性的要求就非常高，活性太高了，蛋白药物自身就可以实现共价交联；而反应活性太低，又无法实现共价反应。其次是交联的氨基酸侧链的选择，常见的交联基团主要是巯基和氨基，但是存在如下问题：
1. 跟巯基反应（Cys），目前最成熟的反应就是跟巯基反应，然而蛋白质药物的靶点多是分泌蛋白或者膜蛋白的胞外区，很少有裸露的巯基可以反应。2. 跟氨基反应（Lysine），然而在生理条件下，lysine的pKa是10，基本上处于质子化状态，可以说基本上不反应。
3. 其他氨基酸就更难了，这里不一一表述。这篇文章巧妙之处是利用特殊的fluorosulfate基团跟histidine反应，histidine的侧链pKa是6，偏向于中性，在生理pH7.4很容易参与反应，这也是为什么histidine经常在酶的催化中心其关键作用。Fluorosulfate这个官能团非常特殊，14年的时候, Barry Sharpless发了SuFEx文章后引起了化学界很大的影响，董佳佳老师又进一步的将该反应应用于药物制备。王磊老师的这篇工作巧妙了利用了含有该基团的非天然氨基酸FSY所介导的共价反应，并将之应用到蛋白药物上。将非天然氨基酸技术用在制药领域将是一个非常重要的趋势，共价蛋白质药物未来将会大发异彩。

参考资料：

1.Developing Covalent Protein Drugs via Proximity-Enabled Reactive Therapeutics

2.Covalent Inhibition in Drug Discovery

3.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK65917/figure/CDR0000062956__464/

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