南京大学郭子建院士团队：新型双模式Cys/Hcy探针用于活体近红外荧光成像和比例光声成像

南京大学郭子建院士团队利用对氨基苯硫醚取代商用染料IR-820制备了近红外探针NIR-S。它可以通过与Cys/Hcy发生亲核取代和Smiles重排反应实现对Cys/Hcy的灵敏和特异性识别。研究表明，该探针不仅可以实现对溶液中Cys/Hcy的特异性近红外荧光和光声双模成像检测，还可以应用于活细胞和小鼠对Cys/Hcy的多模式检测。

在生物过程中，Cys/Hcy在调节氧化还原动态平衡方面起着重要作用。特别是，Cys的缺乏与许多症状有关，如肌肉和脂肪丢失、皮肤病变、儿童生长迟缓、肝脏损伤等。另一方面，血浆总Hcy水平升高(﹥12 μM)与炎症性肠病、骨质疏松症、神经管畸形、心血管疾病和阿尔茨海默病有关。此外，还发现Cys/Hcy的显著升高与神经毒性有关。因此，发展强有力的检测生物过程中Cys/Hcy的方法，特别是同时监测体内Cys/Hcy水平是理解其生理和细胞生物学意义的基础。

近年来发展起来的荧光探针可以直观地跟踪细胞内Cys/Hcy，不仅可以检测它们的浓度变化，而且为研究这些生物硫醇的细胞分布提供了方便的工具。然而，大多数荧光探针是用可见光激发和发射的，由于其有限的组织穿透性，用于活体成像并不理想。此外，由于光散射，光学成像的空间分辨率随着组织深度的增加而急剧下降，严重限制了其在活体生物过程可视化检测中的应用。为了克服上述缺点，光声成像被认为是一种很有前途的成像方法，它是光学成像和声学探测的结合，具有较深的组织渗透性(~5 cm)和较高的空间分辨率(﹤1 mm)，可用于活体成像。尽管各种近红外小分子探针已用于H₂S、GSH、ROS、乏氧、极性等的光声成像，但对Cys/Hcy具有特异性的近红外荧光和光声响应的探针仍未被开发。目前，构建光声成像探针的策略主要有三种，即增强策略、猝灭策略和比例策略。其中，与比例荧光探针类似，比例光声探针可以通过比较不同吸收波长的光声信号强度来定量组织中被分析物的浓度。因此，构建比例计量型小分子光声探针来定量体内Cys/Hcy水平一直是很有吸引力和挑战性的。郭子建院士团队近年来致力于荧光和比例光声多模式成像探针的构筑与化学生物学应用。之前，该团队以近红外染料七甲川菁为信号团设计合成了探针HS-CyBz，可用于活体中H₂S荧光/光声双模式比例成像，并且实现了对S-腺苷甲硫氨酸刺激后小鼠肝脏H₂S水平上调的有效成像（Guo Z., He W. et al. J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 17973）。在本工作中，该团队又报道了一例对氨基苯硫醚取代的IR-820近红外探针NIR-S，它可以通过与Cys/Hcy发生亲核取代和Smiles重排反应并且不受GSH的干扰（图1），从而对Cys/Hcy灵敏和特异性地识别，并用于活体的近红外荧光和比例光声成像。图1. NIR-S对Cys、Hcy和GSH的响应机理。 
通过吸收光谱和荧光光谱研究发现，向NIR-S溶液中加入不同浓度的Cys/Hcy可使776 nm处的发射逐渐增强；同时695 nm处的吸光度逐渐增加，而840 nm处的吸光度明显降低，从而使NIR-S的吸收比例 (A680/A840)增加。随后，通过体外光声光谱研究发现，随着Cys/Hcy浓度的增加，NIR-S的最大吸收波长明显蓝移，导致光声信号强度在~695 nm(PA695)和840 nm(PA840)两个选定波长发生变化。光声信号的变化与吸收光谱的变化趋势一致（图2）。

图2. 体外光声光谱实验。(a, c) 在没有或存在10 eq. Cys (a)和Hcy (c)的情况下，NIR-S (25 µM)在不同波长的PA信号强度的归一化光声光谱。 (b, d) 在不同浓度的Cys(b)和Hcy(d) (0-250 µM)存在下，NIR-S(25 µM)的PA信号强度与浓度的关系。插图：在DMSO/PBS缓冲液中，向NIR-S (25µM)加入不同浓度的Cys(b)和Hcy(d) (0-250 µM)后的光声照片。 

由于NIR-S对Cys/Hcy具有良好的荧光和光声响应性能，作者利用该探针进行了近红外细胞造影和活体实验（图3）。结果证实了NIR-S对内源性和外源性Cys/Hcy的体内荧光成像能力。接下来又利用NIR-S在活体小鼠皮下组织中外源性Cys/Hcy进行光声成像（图3）。实验结果表明，NIR-S可实现活体皮下Cys/Hcy的光声成像。因此，本工作为体内Hcy/Cys水平的定量检测提供了一种实用的工具，有利于疾病的早期诊断和治疗。

图3. 双模式活体成像实验。

该项工作以“A dual-modal probe for NIR fluorogenic and ratiometric photoacoustic imaging of Cys/Hcy in vivo”为题发表于SCIENCE CHINA Chemistry “庆祝南京大学化学学科创立100周年专刊”。南京大学博士生方红宝为论文的第一作者，何卫江教授、陈韵聪副教授为通讯作者。

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通讯作者简介

何卫江，南京大学化学化工学院教授，博士生导师。2001年于南京大学获得博士学位，2002年在德国马普胶体与界面研究所进行博士后研究。2003年至今在南京大学配位化学国家重点实验室工作。主要研究方向为：生物相关无机小分子物种的荧光探针设计、细胞/活体造影及其在生物无机化学研究中的应用；光活化金属配合物与生物分子的相互作用；无机金属药物及重金属探针的设计、造影及其在药理、毒理研究中的应用。目前已在J. Am. Chem. Soc.， Angew. Chem. Int. Ed.，Chem. Soc. Rev.，ACS Nano等知名刊物上发表论文近百篇，文章总被引用3200余次。

陈韵聪，南京大学化学化工学院副教授。分别于2008年、2014年在南京大学化学化工学院获得学士和博士学位（导师郭子建教授）。2014年8月至2018年7月，在香港科技大学唐本忠教授课题组从事博士后研究。主要研究方向为荧光探针与成像，以及肿瘤诊疗试剂的开发与应用。迄今已在Chem. Soc. Rev.，Nat. Commun.，J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed.等杂志上发表SCI文章40余篇，文章总被引1600余次，H-index 22。曾荣获博士研究生国家奖学金、南京大学优秀博士学位论文以及江苏省优秀博士学位论文等。

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