今日Cell: 丁胜教授组运用CRISPR成功构建诱导性多能干细胞

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今天，Cell子刊《Cell Stem Cell》在线发表了清华大学药学院丁胜教授研究组的一项研究。研究表明，通过使用CRISPR-Cas9系统靶向激活内源Oct4或Sox2基因，可以成功实现体细胞多能性的诱导。该研究不仅提供了一种构建诱导性多能干细胞的方法，也帮助人们更好地理解了表观遗传修饰调控细胞命运的机制。

导性多能干细胞

2006年，通过向细胞中导入4种转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)，日本科学家山中伸弥在体外诱导成熟分化的体细胞，将其重编程为具有多向分化潜能的干细胞（图1）。这类细胞被称为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)。山中伸弥因此项工作获得了2012年的诺贝尔生理医学奖。

iPSC在再生医学领域有重要应用价值。将患者特异的iPSC诱导分化后，可用于细胞治疗，实现个体化医疗，解决异体移植的免疫排斥问题，同时避开了使用人胚胎干细胞所涉及的伦理障碍。

目前，已先后制备出帕金森病、亨廷顿病、唐氏综合征、1型糖尿病、肌萎缩侧索硬化症等疾病的特异性iPSC。2013-2014年间，日本完成首例临床试验，通过将患者的多能干细胞生成视网膜色素上皮细胞，治愈了年龄相关性黄斑变性，使其重获光明。

图1 iPSC的制备及应用

（来源：learn.genetics.utah.edu）

多年来，为了简化重编程诱导步骤，提高诱导效率，提升应用安全性，研究人员不断尝试优化诱导细胞重编程的方法。丁胜教授也一直在该领域探索，提出了实现体细胞重编程的多种方法。

那么，怎么才能知道体细胞出现多能性呢？ 2012年，一项单细胞水平的研究工作明确了重编程各个阶段的标志基因。通过检测Sox2等多能性相关基因的表达，可以判断细胞是否获得了多能性。将这些诱导获得的多分化潜能的细胞注入小鼠囊胚，如果能够正常分化发育产生小鼠后代，说明所用的iPSC构建成功。

CRISPR-Cas9系统在调控基因表达中的应用

广为人知的CRISPR-Cas9系统常被用于编辑基因，消除特定基因的表达。除此之外，通过对该系统进行改造，还可将其用于激活或抑制基因表达。

具体来说，将CRISPR-Cas9系统中Cas9蛋白的两个具有核酸内切酶活性的结构域HNH和RuvC分别进行H840A和D10A定点突变，从而得到失去核酸内切酶活性的dCas9(deadCas9)蛋白。dCas9无法切割DNA，但dCas9通过与相应的sgRNA结合可以激活或抑制靶基因的表达（图2）。

图2 dCas9可以连接效应子（转录激活子或抑制子）形成融合蛋白，用于靶向基因调控。（来源：abmgood.com，改编自Gilbert等人2013年的图）。

染色体作为遗传物质，是由DNA缠绕在组蛋白上组装而成。组蛋白上发生的甲基化、乙酰化、泛素化，以及DNA上发生的甲基化修饰等都影响着基因转录。这部分内容属于表观遗传学（epigenetics）的研究范畴，即在不影响基因DNA序列的情况下调控基因活性的机制（图3）。

图3 调控基因表达的表观遗传机理

细胞的重编程实则是一个表观遗传修饰重塑的过程。特定的表观修饰能使染色质结构由致密变松散，转录调控蛋白更容易接近基因的启动子或增强子区，进而启动基因表达（图4），改变细胞特征。因此，组蛋白修饰与细胞能否启动重编程、获得多向分化潜能密切相关。

图4 致密染色质中的基因增强子和启动子关闭，阻碍基因表达和细胞重编程（上图）；松散染色质中基因增强子和启动子开放，允许转录因子结合，有助细胞重编程（下图）。

（来源：EMBO期刊）

那么，改变特定基因位点的表观遗传特征，是否就能够触发细胞重编程，或者操纵细胞命运呢？

为了回答这个问题，近期，清华大学丁胜教授组在这方面做出了新的尝试。其中，能靶向特定位点的CRISPR-Cas9系统发挥了重要作用。

通过改变内源基因的表观特征来诱导多能性

与传统的iPSC构建方法不同，丁胜教授课题组并没有向细胞转入外源的多能性相关基因，而是通过重塑内源多能性基因的表观遗传特征，启动基因表达，进而诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程为iPSC。

在这项研究中，丁胜教授课题组使用了dCas9-Sun-Tag-VP64系统（图5）。该系统中的多个VP64转录因子可接近靶基因位点，通过募集多种表观遗传修饰因子，增强染色质重塑活性，启动并增强基因转录。

图5 丁胜教授课题组使用的激活基因表达的dCas9-SunTag-VP64系统(下图)（来源：Cell，2014）

为了监测细胞多能性的诱导过程，他们使用了表达Oct4-EGFP报告分子的细胞——多能性标志基因Oct4被活跃转录的同时，细胞中会检测到强烈的EGFP绿色信号。

在这项研究的开始，他们将含有数个sgRNA（共18个）的CRISPR靶向库导入细胞，使其作用于数个多能性相关基因的启动子区。他们发现，这些基因的转录表达能够使体细胞重编程，形成可以稳定传代的iPSC（CRISPR iPSC）（图6）。

图6 通过靶向内源基因，成功构建能稳定传代的iPS细胞系

为了鉴定出启动重编程的关键基因，他们通过一一删减靶向库中的靶向基因，发现如果不靶向Oct4、Sox2或Glis1基因，具有多能性的细胞群落会大大减少，表明这些基因对多能性的诱导至关重要。同时，他们注意到细胞重编程的效率明显依赖于Sox2基因的表达水平，事实上，单独针对Sox2启动子的改造即能诱导细胞产生多能性。

但是，以上方法获得的iPSC的比例并不高，他们猜测这或许与所使用的小鼠体细胞的遗传背景和转导效率有关。基于这一点，丁胜教授组用之前获得的CRISPR iPSC，构建了二代小鼠胚胎成纤维细胞S-17。他们发现使用S-17细胞进行诱导，可以大大提高重编程效率。

其中，dCas9-Sun-Tag-VP64系统可通过改变Sox2和Oct4基因启动子区的组蛋白乙酰化水平，来启动二者的表达。他们还证明，靶向Sox2单基因座能启动其转录表达，继而诱导其他多能基因表达，建立多能性网络。

在这个研究过程中，丁胜教授研究组注意到Oct4启动子和增强子的表观重塑对于多能性诱导非常重要。但是仅靶向Oct4的启动子不足以产生EGFP阳性细胞集落。在高表达Oct4的小鼠胚胎干细胞中，Oct4基因的远端增强子处富集着p300、介体复合物和关键多能性因子。因此，他们推测细胞多能性的诱导可能需要同时重塑Oct4的启动子和增强子。

为了验证这一点，他们使用了转录靶向两个不同位点的双sgRNA，在单细胞水平上同时靶向Oct4启动子和增强子区，提高了组蛋白乙酰化水平，并最终实现了重编程的诱导。在获得了具有多能性的细胞之后，他们将其注射入小鼠囊胚，成功实现了种系传代。

这些数据表明，通过同时重塑内源性Oct4的启动子和增强子区的表观特征，能够有效地诱导出细胞多能性。

然而，在这个靶向系统中，VP64的染色质重塑功能主要是因为它能够招募转录因子和表观修饰因子，而非直接改变表观修饰。那么，直接重塑表观特征是否足以启动重编程呢？

为了明确这一点，丁胜教授组采用了另一个靶向系统——dCas9-SunTag-p300core，该系统能够特异性地增加Oct4启动子和增强子区的组蛋白乙酰化水平。

p300是一类乙酰基转移酶，通过与CRISPR-Cas9系统联合，成为了一个非常强大的操纵基因表达的工具。p300 core是p300的活性结构域，它取代了之前系统中VP64的位置，可以增强靶标的组蛋白乙酰化水平（图7）。

图7 dCas9与p300的核心催化结构域融合，可以使靶位点乙酰化，发生表观构象重塑。该作用与转录因子、RNA聚合酶II协同上调靶基因转录。（来源：abmgood.com，改编自Zentner等人2015年的图）。

丁胜教授组发现，p300 core的组蛋白乙酰化靶向功能类似于VP64的染色质重塑功能，都能够重塑Oct4启动子和增强子的表观特征，并足以触发重编程，使细胞获得多能性。这项结果有力地证明了单独改变基因的表观特征即能实现重编程。同时也证明了组蛋白乙酰化在iPSC诱导过程中的关键作用。

小结

多能性干细胞的诱导通常需要引入转录因子来激活多能性网络。但是人们并不清楚到底是哪些内源性染色质的重塑事件触发了重编程。

在这项研究中，丁胜教授组采用CRISPR激活系统靶向内源基因Oct4和Sox2（图8），精确重塑这两个基因位点的表观特征，最终成功构建了iPSC，帮助人们更好地理解了定向染色质重塑触发重编程的机制。

图8 利用CRISPR-Cas9系统构建iPSC (来源：Liu et al., 2017, Cell Stem Cell)

这项研究中使用的重编程技术也应该适用于其他的细胞类型以及模型。在人类细胞中的应用情况有待进一步研究确认。

论文中还提到，除了p300之外，已被证实还有其他几个表观遗传修饰因子（Tet1、Dnmt3a、KRAB和LSD1）也具有编辑表观基因组的功能，可以用于激活或沉默基因。联合CRISPR系统的靶向功能，这些工具均可以应用于对不同类型的DNA和组蛋白修饰进行定向编辑，进而操纵细胞命运。

参考文献：

1 Buhe Nashun, et al., Reprogramming of cell fate: epigenetic memory and the erasure of memories past. The EMBO Journal 2015 34, 1296-1308

2 Nasir Malik, et al., A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods Mol Biol. 2013 997: 23–33

3 Barbara Jusiak, et al., Engineering Synthetic Gene Circuits in Living Cells with CRISPR Technology, Trends in Biotechmology, 2016 34, 7:535–547

4 Tanenbaum ME, et al., A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014 23;159(3):635-46

5 Liu et al., CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency, Cell Stem Cell 2017, https://doi.org/10.1016/j.stem.2017.12.001

6 Dominguez AA, Lim WA, Qi LS. Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 17(1):5-15.

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