“基因魔剪”不灵了？96%的人对CRISPR存在预先免疫力

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近期，一项发表在《自然·医学》上的研究表明，大部分人对Cas9蛋白存在预先免疫力，Cas9蛋白作为CRISPR-Cas9基因编辑疗法的重要组成部分，若它受到人体自身免疫系统的威胁，那么CRISPR-Cas9 基因编辑技术的“切割”工具可能就会失灵了。

在这项最新的研究中，来自德国的研究团队将48名健康志愿者的血液样本暴露于Cas9蛋白酶中，这种酶来自一种名为Streptococcus pyogenes（酿脓链球菌）的细菌。 而Cas9是CRISPR基因编辑技术中最常用的DNA切割酶之一。结果显示，该研究中96％的人对Cas9具有T细胞免疫力，85％的人血液中预先存在针对它的抗体。CRISPR-Cas9基因编辑技术貌似再次遭遇挑战。

事实上，CRISPR从面世的现在，整个路途可谓一波三折。

CRISPR-Cas9技术自2012年被发现以来，研究浪潮在短短几年间就席卷了整个学术界，应用潜力大到令人咋舌，是当之无愧的“明星技术”。而CRISPR-Cas9的几位研究先驱也相继得到了引文桂冠奖的垂青。但是由于CRISPR/Cas9技术在基因编辑领域的巨大经济价值，它的专利归属也成为了科学家及其背后所依托的利益集团的争夺焦点。这场专利之争分为两大阵营，一方为Jennifer Doudna 和EmmanuelleCharpentier两位美女科学家所领衔，另一方则是学术界冉冉升起新星——华裔科学家张峰。饶有意味的是，引文桂冠奖在2015年颁给了Jennifer Doudna 和Emmanuelle Charpentier，2016年又颁给了张峰。

美东时间2017年2月15日，美国专利局审查与上诉委员会作出裁决，判定张锋及MIT和Harvard的Broad Institute所申请的CRISPR基因编辑专利，与加州大学伯克利分校Dougna和欧洲合作者Charpentier的CRISPR发现，并不存在冲突，"no interference in fact"。也就是说，两家发现并不重复，张锋与Broad Institute得以保留其CRISPR专利权。这场天价的专利争夺战，至少在当前已经结束，张锋取得巨大胜利。详情参见知社报道张锋与MIT在CRISPR世纪争夺战中取得决定性胜利 | 今日快讯。

然而这场争夺战落幕不久，北京时间2017年5月30日，期刊《NatureMethods》刊登了题为“Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo”的文章，又将CRISPR推上浪潮。该文指出CRISPR-Cas9技术会导致小鼠体内数百个非目标突变。显然，这对于享有“上帝之手”“基因剪刀”之称的基因编辑技术CRISPR的脱靶性问题提出了质疑。但论文一经发表，便引起了生物界的广泛批评。人们认为该论文实验设计不科学、数据不充分。详情参见知社报道基因剪刀CRISPR–Cas9遭质疑,《自然》子刊编辑重点关注。

此后， 北京时间2018年1月5日，斯坦福大学医学院Matthew Porteus领导的研究小组在生物学预印本网站 bioRxiv 上发表了一篇未经同行评议的文章，记录了研究人员对数十人进行的血液测试，结果显示，65％的捐赠者具有针对酿脓链球菌Cas9的抗体，但无法检测出针对该酶的T细胞活性。该研究发现“人类对任一 Cas9 同系物预先存在的适应性免疫应答，可能阻碍 Cas9/gRNA 系统安全有效地用于治疗疾病，甚至还可能对患者产生显著的毒性”。该论文发布当天，Editas公司的股价应声大跌，Intellia 和 CRISPR 两家也未幸免于难。

如今，发表在《自然·医学》上的这篇文章更加强有力地证明了这一结论。作为领域内领军人物之一，柏林Charité大学医学院的Michael Schmueck-Henneresse在一封邮件中表示，最初他对96％的调查结果感到十分惊讶。“但这是有道理的，因为酿脓链球菌是导致人类细菌感染的最常见原因之一，我们都经历过多次感染，甚至它可能已经定植于我们体内了，因此未来我们需要投注更多的关注在CRISPR-Cas9的免疫问题上。”

那么CRISPR疗法能否如传言所说最早明年进入人体检测阶段？它究竟会在人体里发挥什么样的作用？这些问题取决于多种因素，例如CRISPR-Cas9系统在体内如何被包装和传递，它的靶向组织是哪些等等。Intellia Therapeutics公司表示，他们一直在研制能够避免T细胞免疫反应的CRISPR系统，以期开发以CRISPR为基础的药物，输送到身体特定部位来治疗各种遗传疾病。当然，在其它一些体外项目中，这个预先免疫反应就不存在了。对于这个体内计划，Intellia目前正在尝试使用脂质纳米颗粒（LNP）将CRISPR递送到肝脏。 Intellia发言人Jenn Smoter表示，该项研究目前已经到了动物实验阶段，没有发现T细胞介导的Cas9细胞毒性表达的迹象。

Schmueck-Henneresse 同时提醒一定要谨慎开展临床实验，CRISPR药物开发上应尽量减少Cas9在细胞中活化的时间，给第一批患者服用的时候可以配合免疫抑制剂服用。

澳大利亚国立大学的基因组编辑专家Gaetan Burgio在年初发推特说，虽然人体Cas9的预先免疫力比脱靶效应更令人担忧，“但是预先免疫力的问题是有办法避免的，在bioRxiv发布文章以后，也有其他研究展示了如何通过修饰Cas9蛋白或使用Cas9直系同源物来规避这一问题。大家别慌！”

Schmueck-Henneresse则进一步表示，围绕解决预先免疫问题的另一方案是使用其它DNA内切酶，但其它的Cas酶也都来自人体常接触的细菌，他的团队测试了Cpf1酶，结果依然会出现免疫反应。他建议从不会感染人类的细菌中寻找Cas9。他补充道：“大家不必为这个结果感到恐慌。免疫反应是在基因治疗领域是长期存在的问题。”

CRISPR技术从现世到现在一路走来，有无数荣光，也有无数争议。学界的风波不断震荡着股市，而眼前的预先免疫问题会是它最后一个需要被攻克的壁垒吗？究竟什么时候它才会在大众医疗中闪亮登场？抑或是未来还将带给我们其他的惊喜或失望？

让我们拭目以待。

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