质粒构建：从入门到精通之初窥门径

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编者按

很多人的科研生涯中都会绕不开质粒构建这个坎，那么质粒如何而来呢？前人遗留？实验室没人做过这个基因怎么办？公司购买？周期长、成本高还不一定靠谱怎么破？找相关文章作者索取？耗时费力却不一定得到回音如何是好？

正所谓自己动手丰衣足食！所以还是自己构建吧！啥？不会！没关系，本文正合适啥都不会的实验小白！嗯？我已经会了！没关系，相信你读完本文之后也会受益良多的！（Note：因本系列文章主要面向实验小白，所以写的非常详细，已经掌握所述技能的可以略过）好了，小编就不在废话了，让我们简单粗暴的直接进入主题吧！

读完本文您将获得以下技能

0. 学会获取目的基因的CDS序列；
1. 学会设计引物；
2. 掌握Primer Premier 5的使用方法；
3. 懂得如何选择以及在引物上添加酶切位点；
4. 获取cDNA的多种渠道；

5. 初步掌握质粒构建的技能；

6. 获得快速构建质粒的高逼格技能

设计引物

通常我们要通过PCR获取目的基因片段，所以质粒构建第一步就是设计引物。首先大体了解一下引物设计的一些通用原则：

1. 引物长度一般在15~30 bp，最常用的是18~27bp；2. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好在72℃左右。Tm值简单粗暴的计算方法为Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，或在此基础上减5℃；3. 引物3’端不能选择A，最好选择T，G/C的错配率介于A/T之间；4. 以上为最主要的原则，另外还要注意引物的特异性、引物内部不能形成二级结构等原则，具体可以百度之；

当然以上原则并不一定非要完全符合，但是作为一个新手而言初期最好是严格遵守为妙。下面就以构建人源PD1(PDCD1)为例为大家讲解。

CDS的获取

要设计引物自然要知道这个基因的CDS序列了。获取一个基因CDS序列的方法如下：

打开NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了）

然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图）

点击CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。

还可以点击右下角的FASTA得到下图所示内容，这边也可以方便的复制目的基因的CDS序列。

由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物，例如：

正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向，一般不会从3’到5’，所以我们的CDS虽然没有注明方向，但是其实也是5’到3’。

虽然可以这么简单粗暴的设计引物，但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。

Primer 5的使用

如下图，首先点击File->New->DNA Sequence，

然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。

点击左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense

如果对现在的引物不满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们删除掉末尾三个碱基，之后需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。

最后点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便，Primer 5还有很多强大的功能，你可以自行探索，也可以加小编微信(amateur_1988)拉入官方微信群交流。

这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。

选择载体

根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。

从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择，那是不是每个位点都可以用呢？当然不是！我们要选择那些PDCD1（或其他目的基因）本身没有的酶切位点！所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不可以选，其他的都可以选。
不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。于是我们得到如下引物：

好了，我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。

质粒构建

终于到正题了！

待引物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到100 μM作为母液，取一些稀释到10 μM做下一步实验了。

首先我们P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶，小编常用的是Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶。反应体系及反应条件如下图：

模板的获取

1. 找到表达（最好高表达）该基因的细胞或者组织，用TRIzol法抽提RNA，然后用反转录试剂盒得到相应的cDNA作为模板；
2. 免费索取。给大家推荐一个可以免费索取cDNA的地址：http://hanlab.xmu.edu.cn。韩家淮院士为大家免费提供cDNA，只需要进入该网址点击左侧导航栏的“cDNA索取”即可免费获取韩家淮院士实验室的cDNA了！

PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切，同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址http://t.cn/RVuwBVo查询双酶切所用的最佳Buffer。

酶切回收之后的片段进行连接，小编使用的是Thermo公司的T4连接酶，体系如下：

现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成，不过小编保险起见，一般连接30 min，切勿连接过夜！

连接完成之后便是转化，挑菌（单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！

相信你只要按照上述步骤来做就可以构建出一个质粒了！但是……好麻烦啊！有木有！木有！有！！就没有一种简单迅速的方法构建质粒么！好吧，小编也不藏着掖着了，下面就给大家推荐一款简单快速高效构建质粒的方法！

汉恒无缝克隆试剂盒

汉恒HB-infusion^TM

无缝克隆的优势

✔颠覆传统克隆，无需酶切

✔多片段一步快速克隆拼接

✔兼容任意载体，任意位点

✔阳性率高达100%

✔半天轻松搞定克隆构建

HB-infusionTM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。HB-infusionTM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25bp同源序列（图1）。

将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusionTM Master mix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶在50℃反应20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。

图1. HB-infusion^TM快速克隆试剂盒原理示意图

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