千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病
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合作单位：中山大学附属第一医院
合作成果：
Biochemical Pharmacology, 2016, 116: 200-209. (2016 IF = 4.581)
发明专利: CN105085620 A
国家自然科学基金: No.81300615
本文主要讲述了一种“神奇的”小分子——蛋白降解靶向联合体（Proteolysis Targeting Chimera, PROTAC）的诞生过程，它能够在细胞内特异性识别并降解蛋白Smad3，进而阻断肾纤维化以及相关癌细胞的增殖。
1 背景知识
众所周知，细胞每时每刻都会生产新的蛋白，那些使用过或表达出错的“垃圾蛋白”会被降解。泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway, UPP)是细胞内迅速降解“垃圾蛋白”的主要方式。UPP由泛素分子(Ubiquitin, Ub)、26S蛋白酶体、泛素激活酶E1、泛素转移酶E2和泛素连接酶E3组成[1]。在真核生物细胞内，有1种E1和约50种E2，却有超过600种结构不同的E3，E3主要参与靶蛋白的识别过程，不同的E3可以识别不同的靶蛋白。UPP过程如图1：首先泛素激活酶E1负责活化泛素分子并将其结合到泛素转移酶E2上；然后泛素连接酶E3与需要被降解的靶蛋白结合；接着，泛素转移酶E2上连接的Ub转移到靶蛋白上，进而使靶蛋白被泛素化标记；最后，被标记的靶蛋白会迅速被蛋白酶体降解成氨基酸片段。
图1 UPP过程。[图片源于Mol. Cancer Ther. 2012,11(3):538-548]
基于上述泛素化降解靶蛋白机制，能否将其应用到疾病治疗上呢？比如降解疾病相关蛋白，达到治疗目的。想法很美好，但其中最大的困难就是如何让E3特异性识别那些疾病相关蛋白。
为了解决上面的难点，接下来为大家请出本文的“主角”——PROTAC。它是一种小分子，由靶蛋白识别配体、Linker和E3识别配体三部分组成。PROTAC的神奇之处在于可以作为媒介连接泛素连接酶E3和靶蛋白，这就让利用UPP机制特异性降解疾病相关蛋白的想法成为可能。PROTAC通过UPP降解靶蛋白的过程如图2所示。不同的PROTAC可以识别不同的靶蛋白，因此PROTAC作为一种具有特异性识别并诱导降解靶蛋白的小分子化合物，具有不可估量的临床应用价值。
图2 PROTAC通过UPP降解靶蛋白的过程。
了解UPP和PROTAC的背景之后，接下来为大家介绍本文的“配角”——Smad3蛋白。该蛋白是细胞内与组织纤维化和癌症密切相关的蛋白，组织纤维化是目前许多疾病致死的主要原因，主要病理表现为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，进而会引起器官损伤和功能减退。研究发现，Smad3缺失小鼠的脾细胞受到特异性刺激后不会出现增殖反应，因此降低Smad3蛋白水平成为治疗组织纤维化以及癌症的方法之一[2]。
2 方案设计
基于Smad3的潜在应用价值，合作单位拟以该蛋白作为研究对象，并期望得到具有特异性降解Smad3的PROTAC。经深入沟通，我们设计了具体的研究方案，如图3。首先采用同源模建和蛋白-蛋白对接方法确定Smad3与PROTAC的结合位点；再使用分子对接方法对Enamine化合物库中的130多万分子进行虚拟筛选，得到100个化合物；经人工目筛得到可链接Linker的13个靶蛋白识别配体；合作单位用SPR验证得到与Smad3亲和力最高的化合物8，最后得到1个PROTAC用于生物活性测试。
图3 降解Smad3蛋白的PROTAC药物分子设计。
2.1 Smad3与配体结合位点的确认
分子对接关键步骤——靶蛋白与配体结合位点的确定。经文献调研，发现Smad3上仅有其抑制剂结合位点。按常规讲，将蛋白抑制剂作为PROTAC的靶蛋白识别配体岂不两全其美[3]，一方面可以发挥抑制功能，另一方面还可以促进蛋白的降解。但Smad3很特别，基于以上机制设计PROTAC是不科学的。因为Smad3只有被磷酸化之后才能被降解，而抑制剂的结合会阻碍其磷酸化[4]，因此抑制剂的结合位点不能作为PROTAC与Smad3作用的位点，我们需要在Smad3上寻找一个新的位置来结合PROTAC。
我们进一步调研文献，发现共阻遏因子c-Ski也能与Smad3结合，并且c-Ski还能加速Smad3的泛素化进程[5]，但其与Smad3具体的结合位点尚未报道。因此，我们采用Smad3与c-Ski结合的位置作为设计PROTAC的结合位点，确认结合位点的具体步骤如下：
① 使用MolDesigner分子模拟平台v1.2的同源模建模块构建c-Ski的三维结构，并评价其结构合理性；
② 采用蛋白-蛋白对接模块搜寻二者最理想的结合构象（如图4所示），通过对结合构象的整体结构、静电势以及疏水性质进行分析，并参考Fukuchi的研究[5]，最终选定了Smad3上的Phe247和His248区域作为其与PROTAC的结合位点。
图4 Smad3和c-Ski的结合构象（蓝色表示Smad3，黄色表示c-Ski，Smad3中参与结合的氨基酸用红色stick表示）。[图片源于Biochem. Pharmacol. 2016,116:200-209]
2.2 虚拟筛选实验
虚拟筛选（Virtual Screening）能够大大缩短药物研发的周期，是药物发现的一种常用技术。本课题采用基于分子对接的虚拟筛选技术，其基本思路是通过计算化合物库中小分子与靶蛋白的亲和力强弱，来预测候选化合物的生物活性。
在确定Smad3结合位点之后，我们采用虚拟筛选结合人工目筛的方法，对Enamine库中超过130万个化合物进行筛选，得到与Smad3具有潜在亲和力的13个候选化合物。筛选流程如图5所示，主要包含：
① 使用“类药性五规则”进行初步筛选；
② 依次采用快速、标准和精细对接模式进行筛选，并分别取打分靠前的10%，共328个分子；
③采用MM/GBSA (Molecular mechanics combined with generalized Born and surface-area solvation) 方法对上一步得到的化合物进行结合自由能计算，取能量最低的前100个化合物；
④ 基于结合模式（主要考虑氢键、疏水作用和静电作用）以及PROTAC可合成性（主要考虑是否易与Linker发生酰化或酯化反应、分子极性和末端氨基或羟基的柔性等），最终获得13个候选化合物。
图5 基于分子对接的逐级虚拟筛选流程。
2.3 生物活性实验验证
合作单位采用SPR检测了13个化合物与Smad3的亲和力，结果显示11个化合物具有活性，占比85%。其中化合物8与Smad3的亲和力最强。以化合物8为靶蛋白识别配体构建出最终的PROTAC，如图6A所示。细胞实验结果表明（图6B），该PROTAC可以泛素化降解Smad3。经过大胆假设，细心求证，精心设计，最终得到的PROTAC不负众望。该研究结果为针对Smad3相关疾病的新药研发奠定了基础。
图6 A: 构建得到的PROTAC结构; B: 786-0(人肾透明细胞腺癌细胞株)和ACHN (人肾癌细胞株)细胞中的VHL水平和Smad3蛋白水平（MG132: 蛋白酶体抑制剂；GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脱氢酶）。[图片源于Biochem. Pharmacol. 2016, 116: 200-209]
3 展望
本课题采用基于分子对接的虚拟筛选技术，从130多万化合物库中筛选出与Smad3具有较高亲和力的小分子，再连接Linker和E3识别配体得到完整PROTAC。该PROTAC经细胞实验验证，具有泛素化降解Smad3功能。该研究思路可以为其他与疾病发生发展相关蛋白的泛素化降解提供指导，如与抗炎、抗肿瘤相关的BET(Bromodomain and extra-terminal)蛋白[3]，KRAS蛋白，β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein, Aβ)，雌激素受体蛋白[6]，抗逆转录病毒相关的APOBEC3酶[7]等。
参考文献
1. Cell Mol. Life Sci. 2008, 65(15): 2397-2406.
2. EMBO. J. 1999,18(5): 1280-1291.
3. J. Med. Chem. 2017, 61(2): 462-481.
4. Nat. Cell Biol.1999, 1(8): 472-476.
5. Mol. Biol. Cell. 2001, 12(5):1431-1443.
6. Mol. Biosyst. 2011, 7(2):359-364.
7. Arch. Pharm. Res. 2015, 38(4):435-445.