食品加工工艺机制研究: 高密度CO2诱导肌球蛋白自组装（上）
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合作单位：广东海洋大学食品科技学院
合作成果：
1. Journal of CO2 Utilization, 2017, 21: 270 - 290. （2016IF = 4.292）
2. 国家自然科学基金: No.31371801
摘要：本文分享了分迪科技采用同源模建和分子动力学方法，模拟高密度CO2 （Dense-Phase Carbon Dioxide，DPCD）条件下肌球蛋白结构改变的过程。该研究从分子层面阐明了该条件诱导肌球蛋白三维结构改变并自主装的机制。这为改善DPCD加工工艺在保持食品口感和色泽上的功能奠定了基础。
1 研究背景
虾肉中富含肌球蛋白，经绞碎、斩拌成黏稠的浆料，待成型后加热，形成具有三维网络弹性的凝胶体[1,2]。DPCD是非热加工技术，在确保食品安全的同时，还能保持虾肉原有的色泽和风味。这是因为，虾肉绞碎后，经DPCD处理，肌球蛋白可以形成致密的凝胶网络，最大程度地保留了虾肉中的水分。合作单位将DPCD处理后的凡纳滨对虾肌球蛋白进行了酪氨酸荧光检测，发现处理后的蛋白荧光增强[3]。故推测，DPCD加工工艺使得蛋白疏水残基暴露，更易形成致密凝胶网络。但，DPCD引起肌球蛋白结构改变并自主装的过程和作用机制是什么呢？实验无法阐明。基于上述问题，我们与合作单位深入沟通，达成一致，拟定以下计算方案。
2 方案设计
图1 DPCD条件下肌球蛋白模拟方案
我们使用合作单位提供的凡纳滨对虾肌球蛋氨基酸序列，采用MolDesigner分子模拟平台v1.6的同源建模模块构建了该蛋白三维结构。使用平台的动力学模块在DPCD溶液环境下进行分子动力学研究。最后，分析动力学轨迹，从分子层面阐明肌球蛋白结构改变并自组装的过程和作用机制。
3 研究结果
3.1 肌球蛋白结构确定
图2凡纳滨对虾肌球蛋白Blast结果。[图片源于：BLAST: Basic Local Alignment Search Tool]
巧妇难为无米之炊，没有蛋白三维结构就无法开展后续研究。蛋白晶体结构数据库（Protein Data Bank，PDB）检索结果显示，无凡纳滨对虾肌球蛋白的三维结构。Blast的结果显示，没有序列一致度高的蛋白三维结构模板（如图2所示），这大大增加了同源建模的难度。因此，我们使用了MolDesigner分子模拟平台v1.6的同源建模模块[4]、SWISS-MODEL和I-TASSER建模软件（均采用默认参数）对该蛋白进行同源建模，结果如图3所示。
图3虾肌球蛋白同源建模模型；（A）MolDesigner分子模拟平台v1.6的同源建模模块；（B）SWISS-MODEL；（C）I-TASSER；（D）肌球蛋白的结构示意图。[图片源于：Journal of CO2 Utilization, 2017, 21:270-279]
通过对比三个模型结构，发现使用平台v1.6的同源建模模块得到的肌球蛋白模型最为合理。理由如下：
① 该模块构建的肌球蛋白三维结构与实际描述最为相符。经对比图3 A、B、C与D的结构，发现图A的结构与图D最为符合——肌球蛋白头部为球状，尾部呈螺旋状。
② 该模块构建的模型质量最高。经对比三个模型的拉氏图、Profile 3D以及ERRAT结果，发现YASARA得到的模型打分最高或评价最好。
因此我们选择该模块构建的模型进入后续研究。
3.2 pH值确定
根据合作单位所提供的pH值（pH=7.0）进行模拟，我们发现该条件下肌球蛋白结构一直未能松散。为解决此问题，我们再次调研文献，发现DPCD条件下溶液环境应呈强酸性。经与合作单位沟通，其认可我们的发现。根据CO2密度，我们设置对应的pH值（pH = 3.0）。
3.3 体系构建
在得到蛋白结构和确定pH值条件后，我们使用MolDesigner分子模拟平台v1.6的动力学模块构建了肌球蛋白-纯水和肌球蛋白-DPCD两个体系，各包含396737和405935个原子。我们在该平台上同时开展了该二体系的动力学研究，20ns模拟共耗时8天。
3.4 结构变化
我们对两个体系动力学前后的结构进行了分析，发现有两个原因导致结构松散：
①在DPCD条件下，CO2溶解度大大提升，使溶液环境成强酸性，氨基酸残基质子化，从而破坏稳定蛋白结构的氢键网络，致使蛋白结构松散。如图4所示，相对于纯水环境，DPCD条件下的肌球蛋白的三级结构变得相对松散。
图4 肌球蛋白结构三维结构图（A）0 ns；（B）20 ns。蛋白以cartoon模型显示，蓝绿为肌球蛋白在纯水环境下三级结构，红色为肌球蛋白在DPCD条件下的三级结构。[图片源于Journal of CO2 Utilization, 2017, 21:270-279]
②在DPCD条件下，CO2被压入蛋白内部，其与疏水残基相互作用，使得疏水残基暴露。如图5所示，20ns时，肌球蛋白的疏水区域明显增多，并且CO2富集在橘黄色的疏水区域。
图5 DPCD条件下，CO2 以及肌球蛋白疏水区域随模拟时间的分布情况，（A）0 ns；（B）20 ns。蛋白以疏水表面显示，橘黄色为疏水区域，蓝色为亲水区域，白色为中性区域，CO2以球型模拟显示。[图片源于Journal of CO2 Utilization, 2017,
21:270-279]
4 结论
本研究使用同源建模的方法，构建了肌球蛋白的三维结构，在pH=3.0的DPCD条件下，通过分子动力学模拟研究了肌球蛋白结构改变并自组装的过程，阐明了作用机制。发现有两个原因导致结构松散：其一，DPCD条件下，溶液呈强酸性，蛋白残基被质子化，破坏了稳定蛋白结构的氢键网络；其二，由于CO2被压入蛋白内部，与疏水残基相互作用，使得疏水残基暴露。
5 展望
本文所采用的分子模拟计算方案，不仅适应于凡纳滨对虾肌球蛋白，也适用于DPCD条件下，研究各种肌球蛋白、胶原蛋白、肉类、蛋品以及果蔬等的自主装过程和机制。还可探索和改进DPCD加工工艺的条件（如温度、压强、pH值等）对形成凝胶的影响。
6 预告
本期我们与大家分享了分迪科技如何使用分子模拟技术帮助合作单位阐明DPCD条件下单个肌球蛋白结构松散的原因。后期我们将继续与大家研讨包含3个肌球蛋白的超大体系（含100多万个原子）分子动力学研究，用以阐明在DPCD条件下凝胶网络形成的机制。
参考文献
1. J FOOD SCI,1981, 46(5): 1412-1418.
2. INT J PHARMACEUT, 2010,390(2): 89-99.
3. 广东海洋大学学报, 2016, 36(1): 73-78.
4. Proteins, 2004.57(4): p. 678-83.
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