【分迪看点】：2020年4月23日，复旦大学生命科学院鲁伯埙和丁澦课题组发表综述介绍了新兴降解途径——溶酶体降解技术，指出该技术能和PROTAC形成很好互补，有利于降解更多“不可成药”靶标。
传统药物开发通过抑制靶蛋白活性位点产生细胞效应，活性位点的占据率直接影响靶蛋白功能，这种占位驱动模式使得许多致病蛋白“不可成药”。蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）已成为极有前景的药物开发方法，它能利用身体自有机制来降解这些不可成药蛋白。由于PROTAC存在一定局限性，利用溶酶体降解途径可进一步拓宽靶标的选择范围。本文回顾了溶酶体降解途径的一些新兴关键技术，讨论了它们的潜在应用和局限性。
人类遗传学研究表明，许多新的靶蛋白通过获得功能性毒性而引起疾病。传统的药物开发策略需要占据结合位点进而抑制目标蛋白功能活性，这使得与疾病相关的支架蛋白、转录因子和其他非酶蛋白等都变得“不可成药”。通过增强蛋白质质量控制系统能纠正或降解这些“不可成药”致病蛋白质。例如，通过一些小分子（可靶向分子伴侣或诱导应激反应）对蛋白质稳态网络进行重塑可能会减少多种疾病相关的蛋白聚集并降低其潜在毒性。此外，对于病原性蛋白引起的神经退行性疾病，诱导自噬可能是一种潜在的治疗策略。这些方法虽然具有治疗多种疾病的潜力但会诱导细胞整体变化，可能产生强烈的补偿机制或广泛的非特异性作用来抵消实际效果。选择性降低致病蛋白水平是一种更有效的策略。基于核酸的RNA或DNA靶向试剂进行基因沉默是其中一种方法（图1A），尽管基因治疗很有前景，但仍面临一些关键挑战如难以递送且价格过高。因此，诱导目标蛋白降解的可行性更大且可以满足巨大的临床需求。本文概述了几种降低目标蛋白水平的新技术。图1 已建立的选择性靶向目标蛋白（POI）方法
目前小分子诱导蛋白降解的主要方法是PROTAC技术，该技术因可以靶向“不可成药”蛋白而备受关注（图1C）。PROTAC分子通过拉近靶蛋白和E3连接酶的距离从而提高靶蛋白的泛素化效率，进而诱导蛋白酶体系统对靶蛋白进行降解（图2）。Crews等人在2011-2012年发表了两篇有关小分子疏水标签（HyT）诱导目标蛋白降解的论文。HyT由疏水部分和与靶蛋白结合的部分组成，当HyT与靶蛋白结合后，靶蛋白表面的疏水标签导致热休克蛋白的识别和募集随后被蛋白酶体降解（图1B）。
图2 PROTAC技术示意图
PROTAC分子具有的催化效应使其在较低浓度下仍具有较强的降解能力，但有时需要对该效率进行时间和空间控制。最近有研究报道了可控的PROTAC，例如可光转换的偶氮苯PROTAC（Azo-PROTACs）和光笼PROTAC（pc-PROTACs）。Azo-PROTACs是一种可用于降低细胞蛋白水平的光控小分子，通过控制曝光来反向控制PROTACs活性以调控蛋白降解效率。对于pc-PROTACs，将可光去除的保护基团添加到Brd4的降解剂中，使分子仅在光照射后才在活细胞中显示出降解活性。尽管PROTAC技术前景广阔，但它依赖特定E3连接酶和蛋白酶体会限制其在某些细胞或具有蛋白酶体抗性的蛋白中的应用。令人鼓舞的是，针对溶酶体降解途径（与蛋白酶体无关的降解途径）出现了很多新技术。溶酶体降解途径包括内体/溶酶体途径和自噬途径。内体/溶酶体途径由多个膜结合的细胞区室协同作用，即首先内吞进入细胞的蛋白，然后通过早期内体、内体载体囊泡、晚期内体和溶酶体进行后续降解。自噬途径始于被称为吞噬泡的分离膜结构，该结构来自具有脂质化LC3蛋白的脂质双层膜，吞噬泡通过膨胀进而吞噬蛋白质和其他生物分子甚至包括细胞器的细胞内物质，这些物质被隔离在称为自噬体的双膜囊泡中随后被降解。接下来将主要介绍溶酶体降解途径的主要三种技术。
LYTAC（溶酶体靶向嵌合体）技术是一种利用内体/溶酶体途径降解目标蛋白的方法。PROTAC技术主要针对细胞内蛋白，而LYTAC可作用于膜蛋白和细胞外对PROTAC具有抗性的蛋白质（如EGFR）。LYTAC分子由针对特定目标蛋白的抗体和6-磷酸甘露糖（M6P）共价连接组成。M6P是靶蛋白的聚糖标记，可通过与M6P受体（CI-M6PR）结合而靶向降解该蛋白。抗体可被内源系统识别，其结合的目标蛋白将被转运到溶酶体中进行降解。LYTAC技术的优势在于利用了普遍表达的内源性降解途径降解细胞外蛋白和膜蛋白，主要不足是分子量大且分子中的抗体或多肽可能诱导免疫反应。自噬靶向嵌合体（AUTAC）采用与PROTAC类似的设计，很适合降解胞质中对PROTAC分子具有抗性的目标蛋白。货物蛋白（cargo proteins）首先被吞噬形成自噬体，然后SQSTM1/p62等自噬受体识别Lys63（K63）多聚泛素化货物蛋白，并将它们转移到自噬体进行降解。AUTAC和PROTAC分子均通过泛素化起作用，但AUTAC分子通过触发K63多聚泛素化从而诱导靶标降解。AUTAC分子由降解标签（鸟嘌呤衍生物）和目标蛋白配体连接而成，降解标签模拟了S-鸟苷酸化（S-Guanylation）。S-鸟苷酸化是非常重要的一种翻译后修饰，可以通过诱导K63多聚泛素化来标记底物蛋白从而诱导其进入选择性自噬途径。研究发现AUTAC分子具备降解目标蛋白以及受损的线粒体等细胞器的能力。AUTAC分子通过复杂的多步过程起作用（具体步骤需要进一步研究），需要研究S-鸟苷酸化触发目标蛋白K63泛素化的分子机制并且确定效率和潜在的脱靶毒性。自噬体偶联化合物（ATTEC）是利用自噬降解目标蛋白的一种更直接方法。与PROTAC和AUTAC不同，ATTEC分子与泛素化无关。ATTEC分子可以直接将目标蛋白和LC3结合在一起，促进目标蛋白被自噬体吞噬。mHTT（突变的mHTT）是引发亨廷顿氏病（HD）的主要原因，该蛋白具有重复扩展的多聚谷氨酰胺（polyQ）。研究表明，自噬体偶联化合物可以在细胞或者动物模型体内降解mHTT，并减弱HD相关的表型。体外实验表明，ATTEC分子可以和polyQ特异性相互作用从而选择性降解mHTT且不影响wtHTT水平。ATTEC分子还能够降解其他引起疾病的polyQ蛋白，例如会导致III型小脑共济失调的突变型ATXN3。一些研究已发现ATTEC分子可以通过血脑屏障并在约100 nM的浓度下发挥作用，这为药物发现提供了令人鼓舞的切入点。通过直接与自噬体蛋白LC3相互作用并绕过泛素化过程，ATTEC分子在降解DNA/RNA分子、受损的细胞器等通过自噬识别的非蛋白货物方面具有巨大潜力。ATTEC分子是否会影响整体自噬活性还有待研究。与PROTAC、LYTAC和AUTAC的分子量相比，靶向mHTT的ATTEC分子量非常小，这可能具有更好的药物特性。除PROTAC技术外，本文还展示了三个新兴的降解技术（图3）。尽管每个技术都有其优点和局限性（表1），但它们极大地扩展了降解技术的潜在应用，可能为靶向降解领域的研究开辟新途径。表1 PROTAC和新兴降解技术的对比
自噬/溶酶体降解途径的新方法将大大扩展降解技术的应用范围。目前研究主要集中在致病蛋白，可进一步探索这些新技术降解其它致病靶标如蛋白质聚集体、DNA/RNA分子、过氧化物酶体、核糖体、受损的线粒体或微生物病原体的能力。本文简要讨论使用这些技术降解某些靶标的可能性。阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病等神经退行性疾病都与蛋白错误折叠形成蛋白质聚集体/寡聚体有关。在不影响野生型蛋白情况下，清除这些蛋白质聚集体/寡聚物可能是一种有前景的药物开发方式。理论上，蛋白酶体降解这些聚集体/寡聚物的能力较弱，利用自噬/溶酶体降解途径可能会有更好的结果。ATTEC分子能显著降低突变型HTT聚集体水平，这证实自噬/溶酶体降解途径的优势。鉴于大多数相关疾病是神经系统疾病，为了使降解剂可以透过血脑屏障，需要将降解剂设计成高脂溶性且分子量低于500 Da。较小分子量的降解剂有更多的机会被开发神经退行性疾病治疗的候选药物。有趣的是，最近报道了基于PROTAC系统的Tau蛋白降解剂，该降解剂有效的降解了神经退行性相关的可溶性Tau蛋白，但未测试Tau聚集体，新兴的溶酶体技术可能会更有效地降解这些Tau蛋白。RNA分子被溶酶体膜蛋白LAMP2C识别后转运到溶酶体中进行降解。进一步的研究表明，Putative RNA转运蛋白SIDT2介导了跨溶酶体膜的RNA转运。因此，科学家可以筛选LAMP2C或SIDT2高亲和力的结合分子，并将其与反义寡核苷酸或特异性结合靶RNA的小分子连接构建嵌合分子从而选择性地降解RNA，下调其编码的致病蛋白水平。对于DNA分子，在病理条件下清除胞质DNA分子是非常必要的。环状GMP-AMP（cGAMP）结合酶（cGAS）通过与细胞质中的微生物或自身DNA结合来检测感染或组织损伤。与DNA结合后，cGAS产生cGAMP，cGAMP结合并激活衔接蛋白STING进而诱导LC3脂化并激活自噬。cGAMP诱导的自噬对于清除细胞质中的DNA和病毒至关重要，可通过自噬靶向降解技术来降解这些DNA分子、相关病原体或受损细胞成分。由于胞质DNA无法泛素化，因此最合适的降解技术可能是ATTEC。细菌和病毒感染构成了严重的全球威胁。尽管抗生素治疗已取得巨大成功，但由于耐药性的增加以及新型抗生素的匮乏，人们极需新的治疗方法。ATTEC或AUTAC等自噬/溶酶体降解技术可用于靶向病原体的关键蛋白，从而通过异种吞噬提高对它们的清除率。另一种潜在策略是将ATTEC靶向微生物的DNA/RNA进行自噬降解，也可靶向导致近期爆发的肺炎病原体COVID-19。此外，许多病原体已经进化出破坏或利用这种防御机制的方法，这可通过增强异体吞噬与新型降解技术结合以达到最佳治疗效果。
利用相对非特异性的溶酶体降解途径来选择性降解目标蛋白极大地扩展了靶标的选择范围。LYTAC利用聚糖标签标记细胞外蛋白从而靶向到溶酶体进行降解，AUTAC巧妙地利用S-鸟苷酸化介导目标蛋白K63多聚泛素化后通过选择性自噬途径进行降解，ATTEC通过脂化的LC3直接将目标蛋白束缚自噬体上进行降解。对于这些新技术，需要明确其特异性和潜在的脱靶效应。已有对细胞和组织样品中ATTEC进行蛋白质组学的研究，而有关LYTAC和AUTAC的研究尚未进行。除了蛋白质组学研究测量稳态蛋白质水平外，研究人员还可以研究这些化合物是否与指定目标以外的蛋白质相互作用。从理论上讲，AUTAC和ATTEC可能具有催化性，因为目标蛋白被溶酶体降解后，小分子（如AUTAC和ATTEC）可以进一步回收利用，但这需要进一步测试和验证。LYTAC分子由于其大生物分子性质可能是非催化性的，这种特性可能导致降解效率较低但会提高可控性。对于每种新兴技术，都需要解决一些具体问题。大分子量的LYTAC分子应该被改进成小分子以便递送和预防免疫应答。为此，科学家可以通过筛选或基于结构的设计来识别与CI-M6PR结合的小分子以降低LYTAC分子量。AUTAC的作用机理仍不清楚，尤其是S-鸟苷酸化（S-guanylation）如何诱导K63多聚泛素化，但可以通过相互作用或筛选S-鸟苷化诱导的K63-多聚泛素的修饰物来解决这一问题。与LYTAC和AUTAC研究相比，ATTEC分子的生物学效应的研究已进行的比较彻底，但化合物-蛋白质界面的原子级结构信息尚待解决。尽管这些新兴降解技术具有空前的潜力能极大地扩展降解技术的应用范围，但它们仍处于起步阶段，需要解决众多关键问题。通过合适的研究开发，它们可能成为令人兴奋的新药开发途径。
https://doi.org/10.1016/j.tips.2020.04.005
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