代谢组入门一问一答（二）

Q1非靶向代谢组和靶向代谢组一般选用什么质谱仪器？A质谱仪以离子源、质量分析器和离子检测器为核心，离子源是使分子在高真空条件下离子化的装置，电离后的分子因接受了过多的能量会进一步碎裂成较小质量的多种碎片离子和中性粒子，它们在加速电场作用下获取具有相同能量的平均动能而进入质量分析器，质量分析器是将同时进入其中的不同质量的离子，按质荷比m/e大小分离的装置，分离后的离子依次进入离子检测器，采集放大离子信号，经计算机处理，绘制成质谱图。质谱仪种类非常多，包括四级杆质谱（QMS）、飞行时间质谱（TOF）、三重四级杆质谱（QqQ）、四极离子阱（QTrap）、四级杆飞行时间串联质谱（QTOF）、离子阱-飞行时间质谱（TrapTOF）、静电场轨道阱质谱（Orbitrap）、线性离子阱质谱 (LTQ）。

●非靶向代谢组研究需要采用高分辨率质谱，这样才可以检测到尽可能多的代谢物，因此一般采用飞行时间质谱仪（TOF）和静电场轨道阱质谱（Orbitrap），或者是这两者与其它质量分析器的联用模式：例如四级杆飞行时间串联质谱仪（QTOF）。

●靶向代谢组是针对关注的目标代谢物进行靶向定量检测，目前选择多反应离子检测（MRM）扫描模式的三重四级杆质谱（QqQ）是进行靶向代谢组准确定量研究的首选。

Q2什么是正离子模式和负离子模式？A●不同物质的性质不同，例如碱性化合物（比如含氮的化合物）易带正电荷，这些化合物容易加和质子形成正电荷离子；而酸性化合物（比如含有羧基-COOH的化合物）易带负电荷，这些化合物容易失去质子形成负电荷离子。正离子模式，就是质量分析器只扫描正电荷离子而过滤负电荷离子，进而得到正电荷离子的相关信息，负离子模式，就是质量分析器只扫描负电荷离子而过滤正电荷离子，进而得到负电荷离子的相关信息。通常来说不同样品适合不同的分析模式，容易得到质子的样品适合做正离子模式，容易失去质子的样品适合做负离子模式，因此需要根据实际情况来选择，也可以两种模式都选择。

Q3代谢组学检测中 QC样本如何设置？如何考察检测体系的稳定性？A

●QC样本是为了保证检测体系的稳定性和重复性而设置的，一般是在所有待检测样本提取后，取等体积的所有样本然后混合而成，然后和待检测样本一起进行检测，检测时每间隔一定数量的样本设置一个QC样本。

●可以通过以下方法考察检测体系的稳定性：

a)因为QC样本都是相同的，如果将所有QC样本的总离子流色谱图（TIC）进行重叠，如果所有QC样本的TIC能完全重叠，说明检测体系的稳定性良好，生成的数据结果可信。

b)因为QC样本都是相同的，体现在PCA分析图中，如果所有QC样本能紧密聚集在一起，说明检测体系的稳定性良好，生成的数据结果可信。

c)在数据预处理后，如果QC样本中有超过70%的潜在特征峰（化合物）的相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）不超过30%，就说明检测体系的稳定性良好，生成的数据结果可信。

Q4总离子流图（TIC, total ion chromatogram）和基峰色谱图（BPC，base peak chromatogram）有什么不同？A●经色谱分离后的各物质，依次进入质谱离子源后，电离生成各种质荷比的碎片离子，经过质量分析器分析，进入检测器，收集所有或部分离子的信号，经计算机处理，得到各种质荷比的离子总和及其随时间变化的曲线，称为总离子流色谱图（TIC），横坐标是离子的生成时间或连续扫描的扫描次数，纵坐标是收集存储离子的电流总强度。●经色谱分离流出的组分持续进入质谱，质谱不断扫描采集数据，每次扫描获得一张图谱，基峰色谱图（BPC，base peak chromatogram）就是将每一个时间点选择信号最强的那个离子连续描绘得到的图谱，其中横坐标是保留时间(RT, retention time)，即组分从进样开始到出现浓度最大值时所需的时间，该值用于定性分析（因为不同的物质出峰时间不一样），而纵坐标是离子强度，用于定量分析（同一物质浓度不同，那么峰面积或者峰高也就不一样）。●TIC和BPC都能反映样品代谢物信息，但是有的学者认为TIC图才能真实反映样品信息，所以更偏向接受TIC。

Q5代谢组学分析中常用的PCA、PLS-DA和OPLS-DA有什么区别？A

●PCA(Principal Components Analysis)，即主成分分析，也称主成分回归分析法，是一种非监督（即计算的时候没有分组信息）的数据降维（减少数据集的维数，例如三维变为二维）分析方法，非监督方法是用来探索完全未知数据的方法，对原始数据依据样本特性进行分类，把相似性的数据进行归类，因而相对于监督性的模型分析方法如PLS-DA分析来说，PCA可以更真实地反映组间的差异。

●PLS-DA ( Partial Least Square-Discriminant Analysis )， 即偏最小二乘判别分析法，是一种监督（即计算的时候有分组信息）的多元统计分析方法，它在降维的同时结合了代谢物变化和实验分组之间的回归模型，并利用一定的判别阈值对回归结果进行判别分析。相对于PCA，PLS-DA分析可以进一步显示组间的差异。

●OPLS-DA（Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis），即正交偏最小二乘判别分析，是PLS-DA的延伸， OPLS-DA会把与实验条件无关的变化过滤，因此OPLS-DA比PLS-DA更能体现与实验条件有关的样品差异，因此OPLS-DA比PCA和PLS-DA能使组间样本分离效果更佳，一般PLS-DA可以用于两组及以上组别的比较，而OPLS-DA通常用于两组的比较。此外，在筛选差异代谢物方面，OPLS-DA 比PLS-DA更准确，一般使用OPLS-DA生成的VIP值去筛选差异代谢物。

Q6PLS-DA模型的R2X、R2Y和Q2分别代表什么意思？A●评价PLS-DA 模型会用到R2X、R2Y和Q2这三个指标， R2X和R2Y分别表示PLSDA模型能够解释X 和Y 矩阵信息的百分比，Q2通过交叉验证计算得出，用于评价PLS-DA 模型的预测能力，这些指标越接近1说明PLS-DA 模型越好，一般来说，R2和Q2值大于0.5说明模型较好，如果小于0.5也可以接受，只是模型比较弱。

 Q7PLS-DA模型的置换检验图是什么？A

●虽然相对于PCA，PLS-DA分析可以更大限度显示组间的差异，但是有监督的分类模型缺点是可能会出现过拟合（是指为了得到一致假设而使假设变得过度严格），因此需要验证PLS-DA模型的可靠性，一般使用置换检验（Permutation test）检验PLS-DA模型是否存在过拟合，如果过拟合则说明该PLS-DA模型不准确，那么基于PLS-DA模型得到VIP值不适合用于后期的差异代谢物筛选，而判断PLS-DA模型是否过拟合的标准是：如果Q2的回归线在纵坐标上的截距小于0则说明不存在过拟合，PLS-DA模型比较可靠。

PLS-DA模型的置换检验图

Q8筛选差异代谢物的标准是什么？ A●筛选差异代谢物通用的标准是：VIP（Variable Importance in the Projection）值>1同时p值＜0.05。其中p值（t 检验显著性程度值）来源于单变量分析方法（t检验），而VIP值（PLSDA的变量投影重要性）来源于多变量分析方法（OPLS-DA模型），物质的VIP值越大，说明该物质对造成组间差异的贡献度越大，这说明VIP值相对于p值只关注物质本身在组间的差异程度，其更关注对造成组间差异的贡献程度，因此同时结合单变量分析方法和多变量分析方法可以使结果更加可靠。

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