天昊微生物
16S扩增子绝对定量技术
文章
中国科学院西北生态环境资源研究院的研究成果近期发表在著名胃肠病学期刊《World Journal of Gastroenterology》上，研究成果发现粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可以通过改善肠道失调和减轻炎症来保护小鼠免受肝细胞癌侵害。在这项研究中使用了天昊生物创新型的微生物16S扩增子绝对定量测序技术。在恭喜客户发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目：Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor protects mice against hepatocellular carcinoma by ameliorating intestinal dysbiosis and attenuating inflammation
中文题目：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可以通过改善肠道失调和减轻炎症来保护小鼠免受肝细胞癌侵害期刊名：World Journal of Gastroenterology
肝细胞癌（HCC）是全球癌症死亡的第三大主要原因。肠道菌群可以帮助维持健康的新陈代谢和免疫力。肠道微生物群有助于维持健康的新陈代谢和免疫力。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是促进健康和体内平衡的关键因子，它促进肠道免疫，刺激骨髓前体细胞产生巨噬细胞集落，增强循环单核细胞的抗菌和抗肿瘤活性。因此，GM-CSF可通过调节免疫力和肠道微生态来保护HCC的发展。本文的研究目的是探讨粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）对HCC肠道菌群及代谢特性的影响。
在本文中，将36只雄性BALB/c裸鼠分为3组：对照组（n=10）、HCC组（n=13）和HCC+GM-CSF组（GM-CSF过表达，n=13）。我们利用HCC细胞建立了GM-CSF正常和过表达的HCC原位移植瘤模型。确定了肝损伤、系统性炎症和肠屏障功能。使用16S rRNA扩增子绝对定量测序和气相色谱-质谱（GC-MS）分析粪便微生物组和代谢组学特征。
结果显示GM-CSF过表达显著影响HCC小鼠的肠道微生物群，导致Roseburia、Blautia、Butyricimonass富集增加，同时Prevotella、Parabacteroides、Anaerotruncus、Streptococcus、Clostridium、Mucispirillum数量显著减少。同样，GM-CSF过度表达导致粪便中生物素和油酸水平显著增加，粪便中琥珀酸、腺苷、富马酸、硫辛酸和马来酸水平显著降低。相关分析结果表明，GM-CSF诱导的肠道微生物群和粪便代谢物主要参与与减轻炎症反应、生物素代谢和肠屏障功能障碍有关的途径。
总之，我们的研究结果表明GM-CSF对HCC发展具有保护作用，这些作用可能是由GM-CSF对免疫的调控进而影响肠道微生物及其代谢产物来实现的。这项研究为HCC的治疗提供了新的见解。
肝细胞癌（HCC）是目前导致癌症死亡的第三大原因。我国每年新发肝癌病例约46.6万例，约占全世界病例总数的55%。HCC因其发病率高、预后差、术后复发率高而成为我国极其严重的公共卫生问题。不幸的是，缺乏有效的肝癌治疗进一步加重了患者的整体负担。目前对肠道的免疫学和生化特性的研究比较多，很少涉及到代谢器官。最近的研究重点集中在肠道的重要生理功能上，例如维持能量的动态平衡。
近几十年来，研究人员一直致力于肠道微生物群对人类健康的重要贡献，尤其是代谢和免疫。肝脏是我们身体中最大的实体器官，它处理80%的来自胃肠道的血液。肝脏内大量的常驻免疫细胞调节免疫反应，促进肝脏修复和解毒，抵抗病原体的入侵。肠道微生物群是调节肝脏免疫和维持肝脏稳态的关键因素，其机制包括内毒素、Toll样受体（TLR）和胆汁酸代谢。特别有趣的是，广泛的研究证实了HCC患者和健康对照者之间肠道菌群存在差异。然而，这些发现背后的具体机制仍不清楚。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种宿主细胞因子，可刺激骨髓前体细胞生成单核细胞和巨噬细胞。此外，它还增强了单核细胞的抗菌和抗肿瘤活性。微生物群可以促进GM-CSF的释放，微生物群可以促进GM-CSF的释放，这一过程对维持肠道免疫平衡具有重要意义。有趣的是，巨噬细胞介导的微生物信号感应控制着GM-CSF的水平。HCC患者血清和组织中GM-CSF水平明显降低，相反，我们发现GM-CSF的过表达抑制了肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并促进了它们的凋亡（未发表的数据）。我们假设GM-CSF通过调节肠道微生态系统对HCC起保护作用。在这项研究中，我们检测了GM-CSF过表达对HCC肠道微生态和代谢的影响。我们的研究结果表明，GM-CSF的过表达通过改善肠道失调、稳定肠屏障、减轻炎症和降低血清内毒素水平来保护小鼠抗肝癌。这些发现可能对肝癌治疗具有深远的意义。
本研究经过兰州大学第一医院伦理委员会批准，批准号LLYYLL-2017-18. 按照科技部《实验动物使用规范》(北京，中国)执行。7周龄雄性SPF级小鼠（BALB/C nude），饲喂在无特定病原体（Specific pathogenfree, SPF）环境中，温度控制在 23±2℃，湿度控制在 50%左右，每天循环给予12 h 光照/12 h 黑暗，自由饮食饮水。驯化1周后，将小鼠随机分为3组：对照组（n=10）、HCC组（n=13）和HCC+GM-CSF（GM-CSF过表达，n=13）组。HCC组和HCC+GM-CSF组早期植入皮下肿瘤，成功植入皮下肿瘤后，建立小鼠肝癌原位移植瘤模型。具体操作方法如下：选取过表达GM-CSF的慢病毒，转染人肝癌HCCLM3细胞系，取对数期生长的细胞，无菌条件下注射入裸鼠腋下（1*107/mL/只），4周后，选取裸鼠皮下接种成功的瘤体（直径约1cm，表面无破溃），修剪成1.5*2*1mm3 的瘤块，切开腹壁，暴露肝右叶与切口处，植入之前备用的瘤块，缝合、关腹。待麻醉苏醒后送回笼内饲养，环境同前饲养4周。收集从所有小鼠粪便样品，并将其存储在-80℃冰箱。麻醉小鼠后立即收集血样，并以3,000 rpm离心15min，所有血清等分后均保存在-80℃。肝和结肠样本被分成两半；其中一部分的组织固定在4%中性缓冲甲醛中，用于石蜡包埋，而另一部分在液氮中冷冻并在-80℃下保存用于后续RNA提取。石蜡包埋的肝脏和结肠切片用苏木精染色（HE）可检测肝损伤和结肠形态，并使用NanoZoomer数字病理学进行扫描系统（Hamamatsu Photonics，日本）将这些部分扫描为特定的图像格式，以便进一步评价。全自动生化分析仪（ROCHE CABAS C311，德国）测量丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平。为了间接量化内毒素水平，脂多糖（LPS）的浓度通过ELISA进行测量。免疫炎症因子同样使用ELISA试剂盒测定。将肝脏及结肠组织石蜡切片，使用免疫组化试剂盒进行免疫组化染色，最后采用 NanoZoomer 数字病理扫描仪将染色的切片扫描为特定的图像格式，每张切片在 200×和400×放大倍率进行分析。采用 Image-ProPlus 软件对连接蛋白-1（ZO-1）进行平均光密度（Optical density, OD）测定。根据说明书，使用RNA试剂盒（Qiagen，美国）提取肝脏和结肠组织总RNA。使用一步法SYBR PrimeScript plus RT-PCR试剂盒（Takara，日本），通过Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行实时PCR扩增。PCR引物序列在附表S1中列出。在96孔板中设置复孔，将表达数据标准化为内参GAPDH的表达，并根据△△CT方法计算。使用QIAamp Rapid DNA Kit（Qiagen，美国）从粪便样品中提取DNA。DNA浓度和完整性分别通过NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）和琼脂糖凝胶电泳进行测量。将合适的DNA样品送至上海天昊生物科技有限公司进行16S rRNA扩增子绝对定量测序（V3-V4）。使用安捷伦7890气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）进行代谢组学分析。使用ChromaTOF软件对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。对物质定性工作中，使用了LECO-Fiehn Rtx5数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。最后将QC样本中检出率50%以下或RSD＞30%的峰去除。代谢物由NIST和Fiehn数据库鉴定。采用正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）进行实验组之间的代谢物差异分析。根据从OPLS-DA模型获得的投影（VIP）值和归一化峰面积上的两尾Student t检验的P值，选择差异代谢物；包括VIP值> 1和P值<0.05的代谢物。数据以平均值±SE表示。对于大多数数据，使用具有 Tukey’s post hoc test 单因素 ANOVA 来确定组间差异的显著性。Wilcoxon 秩和检验用于评估 16S rRNA 高通量测序分析中不同群组之间的 α 多样性和主成分。采用PERMANOVA（Adonis）对微生物群落进行了加权和未加权UniFrac距离矩阵和Bray-Curtis距离矩阵的聚类检验。变量之间的相关性为用Spearman秩相关法测定；P值<0.05被认为是显著的。所有数据均使用 SPSS19.0 进行统计分析。
GM-CSF过表达可预防肝损伤，使肝功能正常化，稳定肠屏障，降低HCC继发的血清内毒素水平为了评估GM-CSF对肝损伤、肝功能、肠屏障功能和血清内毒素水平的影响，我们将过表达GM-CSF的慢病毒转染肝癌细胞系，建立了肝癌原位移植瘤模型。HCC+GM-CSF组肝脏形态较单纯HCC组有所改善；HCC+GM-CSF组肿瘤组织浸润也减少（图1A）。HCC组肝组织被广泛浸润，与肝泡状结构的浸润有相当大的关系。相反，GM-CSF对结肠形态无影响（图1C）。HCC组小鼠血清ALT和AST水平明显高于对照组。然而，而HCC+GM-CSF组的ALT和AST水平较HCC组有显著的下降（图1E）。先前研究表明，肠紧密连接损伤与肠屏障功能丧失有关，为了探讨这种可能性，因此，本研究了紧密连接蛋白ZO-1在肝脏及肠道菌群最为丰富的部位-结肠中的表达和分布情况，免疫组化结果显示，HCC下调了ZO-1 的表达水平，而HCC+GMCSF逆转了这一作用，显著增加了ZO-1 的表达，在肝脏（如图1B）和结肠中（如图1 D）的结果一致。同时，HCC+GM-CSF组小鼠肝和结肠ZO-1转录水平的表达上调（图1F）。结果与组织免疫组化一致，GM-CSF可以改善肠道屏障功能。内毒素可以激活特异性Toll样受体；与HCC组相比，HCC+GM-CSF组小鼠的血清LPS水平显著降低（图1G）。总的来说，这些结果表明GM-CSF的过表达减轻了肝损伤，使肝功能正常化，稳定了肠屏障，降低了肝细胞癌的血清内毒素水平。
图1. GM-CSF减轻肝损伤，使肝功能正常化，改善肠屏障功能，降低肝细胞癌患者血清内毒素水平。A：HE 染色评估肝脏组织病理学改变；B：肝脏组织学采用ZO-1免疫组化染色；C：HE 染色评估结肠组织病理学改变；D：结肠组织学采用ZO-1免疫组化染色；E：血清中ALT和AST水平；F：肝脏和结肠中肠道屏障功能的蛋白ZO-1在mRNA水平的表达；G：血清中内毒素LPS水平。
GM-CSF过表达导致细胞因子谱和Toll样受体表达正常化目前的研究表明细胞因子在肝癌的发展过程中起着重要作用。GM-CSF可显著下调促炎性细胞因子[白细胞介素（IL）-1β和IL-2]，并增加抗炎细胞因子水平IL-4和IL-10，对肿瘤坏死因子水平无影响。为了探索和扩展我们的小鼠模型的这些发现，我们测量了肝组织中细胞因子mRNA水平的表达。发现GM-CSF过表达导致IL-1β和TGFβ的表达显著降低；但是，IL-4的表达没有变化（图2B）。此外，我们发现GM-CSF过度表达导致IL-4在结肠中的表达增加，而IL-1β表达无变化（图2C）。Toll样受体（TLR）-4及其共受体CD14是LPS识别的核心。GM-CSF逆转了肝脏和结肠中TLR4和CD14表达的增加。这些结果表明，GM-CSF直接影响TLR4和CD14的表达。
图2. GM-CSF过表达导致细胞因子谱和Toll样受体表达正常化。 A： 血清中细胞因子水平；B和C：肝和结肠中细胞因子基因的表达。
为了进一步了解GM-CSF的保护作用，我们采用16S扩增子绝对定量测序技术对三个研究组的肠道微生物进行了检测，可以同时测量特定粪便细菌群落的绝对丰度和相对丰度。虽然先前的研究报告了特定粪便样本中微生物的相对丰度，但越来越多的关注集中在确定不同样本中目标微生物的绝对丰度上。我们的结果显示，在HCC+GM-CSF小鼠的粪便样本中，Chao指数和可操作分类单元的数量显著增加；但是，香农指数没有显著差异。用加权UniFrac主坐标分析微生物群落间的系统发育关系。对照组、HCC组和HCC+GM-CSF组可以清楚地分为不同的聚类簇。同样，HCC组和HCC+GM-CSF组的肠道菌群结构也清晰地分为不同的群。门水平各细菌群的相对丰度和绝对拷贝数如图3A所示。HCC+GM-CSF组的微生物组成与单纯HCC组有显著差异。值得注意的是，HCC组的微生物绝对丰度比对照组减少了12%。此外，HCC+GM-CSF组粪便中肠道微生物的绝对丰度是HCC组的1.35倍；这些结果表明，GM-CSF限制了HCC引起的肠道失调。所有三个组中确定的肠道微生物群主要包括Firmicutes, Bacteroidetes, Deferribacteres, Tenericutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Cyanobacteria（图3A）。其中，与肝胰腺坏死有关的Tenericutes丰度是对照组的2.45倍。GM-CSF过表达导致与HCC小鼠样本中观察到的相比，Tenericutes的绝对丰度减少了63%。在属水平上（图3B），肠道菌群主要包括Parabacteroides, Prevotella, Anaerobacterium, Eubacterium, Clostridium_lV, Anaerotruncus, Mucispirillum, Rosecusburia, Butyricicoccus。为了评估肠道微生物组在细菌属水平上的差异，我们对三组中最显著的差异进行了统计评估。GM-CSF的过表达导致了Roseburia, Blautia, Butyricimonass的增加，以及Prevotella, Parabacteroides, Anaerotruncu, Streptococcus, Clostridium, and Mucispirillum的显著减少。尤其值得注意的是Prevotella，由于GM-CSF的过表达，其数量减少了1万倍。为了进一步鉴定不同组间肠道菌群的差异，我们基于 RDP 分类数据进行了 LEfSe 分析，确定了HCC和HCC+GM-CSF组之间最重要的差异菌属，包括Prevotella, Clostridium, Anaerotruncu。
图3. 门（A）和属（B）水平主要细菌的相对和绝对丰度。
图4. 肠道微生物在HCC+GMCSF，HCC和对照组中的分布。每个属的绝对丰度在y轴上表示。纵坐标代表三组之间的丰度值。采用Kruskal-Wallis秩和检验对组间差异显著的属进行分析，P值<0.05被认为差异显著。
我们通过非靶向代谢组学研究进一步阐明了肝癌继发的肠道功能障碍。本部分最终共鉴定到305 种代谢物，涵盖以下 KEGG代谢通路：生物素（维生素）合成代谢，鞘脂类代谢，类固醇合成代谢，嘧啶代谢，柠檬酸循环（TCA循环）代谢，嘌呤代谢，嘌呤和初级胆汁酸代谢（图5C）。本部分研究进行了对应的OPLS-DA 分析，如图5 A 所示，得分图显示三组代谢组学数据集明显区分，这些结果表明各组之间粪便代谢组学数据的明显聚类特征。因本部分研究主要关注有助于区分HCC和 HCC+GM-CSF 组之间的差异代谢物。因此，本研究进一步建立了对应于两组的 OPLS-DA 模型，结果显示HCC组和HCC + GM-CSF组可明显区分（图5B）。CC +GMCSF组和HCC组之间筛选到69种差异代谢产物，其中biotin和oleic acid在HCC + GMCSF组显著增加。succinic acid、fumaric acid、adenosine和maleic acid在HCC+GMCSF组显著降低（图5D）。这些差异代谢产物涉及生物素代谢和脂类代谢。
图5. GMCSF能显著改善HCC引起的粪便代谢组改变。 A：对照（紫色），HCC（红色）和HCC + GMCSF（蓝色）之间的OPLS-DA分数散点图比较；B：HCC（红色）和HCC + GMCSF（蓝色）之间的OPLS-DA分数散点图比较；C：三组之间差异代谢途径图；D：HCC组和HCC+GMCSF组之间差异代谢产物的热图。为了进一步阐明GM-CSF改变的肠道微生态的有益作用，本部分研究进行了交互矩阵的相关性分析。该分析限定了以下内容：HCC 组和HCC+GMCSF组之间具有显著改变的代表性微生物（属水平），具有高辨别力的代谢物和其他与肝功能和炎症相关的代表性参数。GM-CSF的过表达可促进HCC发生后肠道微生态和功能的重建。在HCC+GMCSF中丰度显著减少的Prevotella菌与 ALT、LPS水平正相关，与血清IL-10、GM-CSF呈负相关。此外，Prevotella菌的丰度与succinic acid琥珀酸水平呈正相关。同样，另一个显著减少的致病菌Anaerotruncus的数量与血清ALT水平呈显著正相关，与肠道屏障功能蛋白ZO-1和抗炎因子1L-4呈负相关。GMCSF过表达后丰度升高的代谢物生物素，与IL-2呈负相关。succinic acid琥珀酸在GM-CSF过表达后显著降低，其与ALT、AST和LPS呈正相关，与IL-4和IL-10呈负相关。综上所述，这些数据提供了证据，证明GM-CSF在重塑HCC引起的异常的肠道微生态和功能方面发挥着主导作用。
图6. 对照组、HCC组和HCC+GM-CSF组之间的代表性微生物属，特征代谢物，环境因子（肝脏和肠道损伤指数）的相关性分析。使用Spearman的相关分析，采用 P <0.05和r> 0.5的显着关联。其中蓝色节点：代表性损伤参数； 绿色节点：对照组，HCC和HCC + GMCSF组之间肠道微生物差异属；黄色节点：对照组，HCC和HCC + GMCSF组之间差异性代谢产物。节点之间的绿线表示正相关，而红线表示负相关。连接的粗细表示相关性大小，较粗的线表示较高的r值。
各位看官读完上述文章如果有想做微生物绝对定量的想法，天昊生物是国内唯一一家提供 “微生物16S扩增子绝对定量测序”技术的服务商。天昊16S扩增子绝对定量测序技术简介
该技术是一种将qPCR绝对定量技术和常规16S扩增子测序技术合二为一的技术，该方法通过向样品DNA中添加拷贝数已知的内标序列DNA ，微生物DNA和内标序列DNA一起进行PCR扩增，然后一起进行16S扩增子文库构建、测序，再根据内标序列的16S扩增子序列数及其绝对拷贝数绘制标准曲线，计算出样品中OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数。该技术不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析、指标和微生物相关性分析等常规16S扩增子测序分析，关键可以解析样本中总细菌的绝对拷贝数，还可以解析样本中每个物种的绝对拷贝数，因而对微生态学内许多悬而未决的问题具有进一步阐明的潜力。此外，该技术进行细菌拷贝数定量时，构建标准曲线的内标和样本DNA是在同一个样本孔中一起进行PCR反应，所以PCR反应效率相同，因此校正了腐殖酸对PCR的影响，避免了腐殖酸等PCR抑制物对样品细菌16S拷贝数定量的影响，因此针对土壤、水体和淤泥等环境样本，天昊生物16S扩增子绝对定量测序技术计算得到的细菌16S拷贝数相对于qPCR更准确。
天昊16S扩增子绝对定量测序技术
应用情况
目前天昊微生物16S扩增子绝对定量测序技术平台已经完成项目175个，样本数量高达5246个。合作单位包括中国科学院微生物研究所、中国科学院南京土壤研究所、中国科学院水生生物研究所、同济大学环境科学与工程学院、厦门大学环境与生态学院、中国农业大学、南京农业大学、东北农业大学、重庆市农业科学院、盐城工学院、南京财经大学、南京中医药大学、武汉大学中南医院、新疆医科大学公共卫生学院、山东大学齐鲁医院等多个单位，覆盖环境土壤微生物，环境水体微生物和医学肠道微生物等多个领域，利用该技术的项目文章达到7篇，其中包括《Carbohydrate Polymers》（IF=7.182）、《Science of the Total Environment》（IF= 6.551）、《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（IF=4.192）、《Food & Function》（IF=4.171）等国际著名环境科学和食品领域期刊上。目前该技术因其创新性、准确性和稳定性受到客户的广泛好评！ 天昊生物目前是国内唯一一家提供 “微生物16S扩增子绝对定量测序”技术的服务商，热烈欢迎各位老师与我们交流沟通！扩增子绝对定量测序相关链接：
咨询沟通请联系
18964693703（微信同号）
创新基因科技，成就科学梦想