环状RNA在膀胱癌中发挥特殊作用

8月3日，重庆医科大学陈俊霞教授团队在Scientific Reports杂志在线发表了文章，报道发现了在膀胱癌中发挥重要作用的环状RNA及其作用机制(Zhong et al., 2016)，整篇文献从高通量筛选到锁定circTCF25环状RNA，进一步过表达circTCF25深入研究其细胞功能和参与的信号传递通路，思路非常清晰简洁。

作者首先在4例样本中分别分离癌组织和癌旁组织的总RNA，通过高通量筛选技术，最终筛选到469种环状RNA存在差异，其中285种上调，184种下调。作者进一步分析了这些明显差异的环状RNA所对应的染色体位置，绝大部分环状RNA均对应于编码蛋白基因的外显子区，少数来源于内含子，还有一些不明来历的特殊环状RNA。

图1 膀胱癌环状RNA表达状况分析。（来自(Zhong et al., 2016)）

A. 差异散点图，数据做归一化处理，上下两条斜线代表2倍差异界线。
B. 差异分布火山图。
C. 明显变化的环状RNA对应染色体分布。
D. 明显变化的环状RNA所对应的外显子/内含子分布情况。

作者挑选出上调和下调变化幅度最明显的前20种环状RNA列表如下：

图2 差异明显的环状RNA列表。（来自(Zhong et al., 2016)）

作者紧接着分析了这些环状RNA可能结合的miRNA情况，基于TargetScan 和miRanda数据库进行分析，共分析到643种miRNA可能与这些环状RNA有关联。做了所有变化明显的环状RNA所对应的miRNA网络图，也挑取出了上调和下降最明显的20种环状RNA所对应的miRNA网络。。

图3 miRNA结合网络分析。（来自(Zhong et al., 2016)）

A. 所有变化明显的环状RNA所对应的miRNA网络。
B.变化最明显的环状RNA所对应的miRNA网络。

接下来作者挑选出变化最明显的环状RNA进行QPCR验证。选取了6种环状RNA，将验证试验样本数扩大至40例（含芯片分析所用到的4例）。结果证实这些环状RNA的变化趋势非常明显，其中circFAM169A (hsa_circ_0007158) 和 circ-TRIM24 (hsa_circ_0082582)在癌组织中下调最明显，circTCF25 (hsa_circ_0041103)、circZFR (hsa_circ_0072088)、 circPTK2 (hsa_circ_0005273) 以及 circBC048201 (hsa_circ_0061265)上调最明显。

图4 QPCR验证（来自(Zhong et al., 2016)）

作者紧接着针对这些明显变化的环状RNA及所对应的miRNA进行了通路分析。DIANA-miRPath通路分析发现circTCF25可能与肿瘤相关通路关系最密切，它包括miR-103a-3p 和 miR-107的结合位点，而这两种miRNA与肿瘤通路关系非常密切。

图5 特征性环状RNA所对应的miRNA通路分析。（来自(Zhong et al., 2016)）

接着，作者专门分析了circTCF25所对应的miR-103a-3p/miR-107通路的情况。DIANA-miRPath通路分析表明circTCF25-miR-103a-3p/miR-107涉及到13种基因，它们与细胞增殖和迁移高度相关，其中CDK6和CCNE1是细胞周期调控非常重要的因子。

图6 circTCF25-miR-103a-3p/miR-107通路分析。（来自(Zhong et al., 2016)）

根据这些通路分析的结果，作者假设circTCF25通过抑制miR-103a-3p或miR-107，正向调控CDK6的功能，从而促进细胞增殖。于是作者设计实验在T24和EJ细胞中过表达circTCF25，鉴定miR-103a-3p 和miR-107表达情况，及CDK6蛋白表达情况。结果表明过表达circTCF25可明显降低miR-103a-3p 和miR-107表达量，同时提高CDK6的蛋白含量。在膀胱癌组织中也能检测到CDK6过表达的情况，过表达circTCF25还能增加细胞增殖能力和迁移能力。

图7 过表达circTCF25的细胞学检测分析。（来自(Zhong et al., 2016)）

Ａ. 过表达载体设计。

B. T24和EJ细胞过表达效率QPCR验证。

C. miR-103a-3p 和miR-107表达情况分析，

D. 肿瘤组织中miR-103a-3p 和miR-107表达情况分析。

E, F,G..组织学水平分析CDK6表达情况。 

H. 细胞迁移率分析。

I. 细胞增殖能力分析。

本文首次探索了膀胱癌中环状RNA表达情况，发现了circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6通路在其中的重要作用。本文circTCF25环状RNA过表达载体由吉赛生物科技公司的技术人员与本文作者通力合作完成的。文中circTCF25过表达效率高达1.8至2万倍！

参考文献：
Zhong, Z., Lv, M., and Chen, J. (2016). Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Sci Rep 6, 30919.

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