八月份环状RNA研究主要进展汇总

原创 2016-08-31 句月山人 circRNA

2016年8月份已向我们挥手告别了，在过去的这一月中，环状RNA依然火爆，涌现了一大批重要的研究成果，包括环状RNA的全新功能模型：竞争性抑制核糖体RNA加工中间体RNA分子结合PES1蛋白；环状RNA通过与蛋白形成复合物发挥功能；系统分析小鼠和人类组织特异性环状RNA的情况；心肌中发现的RBM20调控一类环状RNA的形成等重要的环状RNA研究论文，也发表了一系列讨论环状RNA功能的重要综述文章。八月份是环状RNA研究丰收的一个月份。

1. 动脉粥样硬化相关环状RNA circANRIL调控核糖体RNA成熟作用过程

8月19日，Nature Communications杂志在线发表了德国慕尼黑Ludwig-Maximilians大学Daniel Teupser教授的一项环状RNA研究的重要工作。报道发现动脉粥样硬化相关的一种环状RNA：circANRIL可以调控核糖体RNA的成熟作用(Holdt et al., 2016)。

这篇文章的故事与传统的环状RNA研究文章思路不太一样，作者首先从与动脉粥样硬化相关的基因区入手，鉴定到在9p21染色质区存在的一种环状RNA：circANRIL，首先证明了circANRIL与动脉粥样硬化的疾病相关性，然后逐步深入分析，排除了miRNA sponge的可能，通过蛋白质组学分析最终发现了circANRIL与核糖体生成有关的PES1蛋白结合，最终证明circANRIL是通过与rRNA前体分子竞争结合PES1影响核糖体成熟进程的。该机制是一种全新的环状RNA功能模型，对环状RNA的研究意义重大(Holdt et al., 2016)。

图1circANRIL竞争性结合PES1抑制rRNA加工过程（来自(Holdt et al., 2016)）

2. 环状RNA与蛋白形成复合物发挥作用：

8月11日，国际知名杂志Scientific Reports 发表了环状RNA功能的重要文章，通讯作者为德国吉尔大学的Albrecht Bindereif教授。本文基于甘油密度梯度离心法分析鉴定到与蛋白相互作用的环状RNA。本文的最大亮点是采用了沉降分析这一传统的生物化学分析技术探索环状RNA相互作用分子(Schneider et al., 2016)。这是研究环状RNA相互作用分子的全新技术思路。

作者首先挑选了12种已知的高丰度的环状RNA分子分析它们在沉降分析中的分布情况，发现这12种环状RNA都存在与游离环状RNA不同的沉降状态，蛋白酶K消化后这一差别消失，因此作者找到了环状RNA与蛋白相互作用的线索。进一步，作者排除了这些环状RNA存在蛋白翻译的可能性。接下来作者挑选了一种肿瘤标志物同时也是RNA结合蛋白的分子：IMP3进行相互作用环状RNA的分析，通过相互作用RNA的二代测序，鉴定其中的环状RNA，最终找出了12种与IMP3相互作用的环状RNA分子，作者也进一步通过沉降分析验证了他们的相互作用，借助信息学分析技术分析了相互作用元件，表明IMP3更倾向于结合富含C/A的序列(Schneider et al., 2016)。本文的工作虽然不是非常系统和严谨，但所采用的沉降分析技术对于环状RNA研究非常有价值，值得各位同行学习。

图2 基于免疫沉淀和RNA-Seq分析鉴定到12种IMP3相互作用的环状RNA分子。（来自(Schneider et al., 2016)）

3. 系统分析人类和小鼠组织特异性环状RNA

8月20日，武汉大学基础医学院何春江教授团队在著名生物信息学杂志Briefings in Bioinformatics发表了一项环状RNA的重要工作，系统分析了人类和小鼠组织特异性环状RNA的表达情况(Xia et al., 2016)。

在本文中，作者主要利用ENCODE和NCBI GEO数据库的在线资源进行了组织特异性分布的分析。作者共从ENCODE数据库收集了16种成年人组织（共计60个样本）和10个人类胎儿组织（共计28个样本）。从NCBI GEO 数据库的数据集GSE64283收集了5种人类胎儿组织（11个样本），从数据集GSE61991收集了9种小鼠组织（15个样本），数据集GSE74747中收集了9个样本。一共比较了123组RNA-seq的数据，依据上述筛选鉴定条件，鉴定到数量非常庞大的TS circRNA，在16种成年人组织样本中找到140681种TS circRNA，在15种人类胎儿组织样本中找到了164069种TS circRNA，在9种小鼠组织样本中找到了15980种TS circRNA。作者进一步分析了这些TS circRNA在总circRNA中的占比，基因结构，保守性情况，各种组织中TS circRNA的分布情况以及它们所对应的基因的功能和通路分析(Xia et al., 2016)。本文对环状RNA研究的贡献还是非常大的，为组织特异性circRNA研究提供了一个平台资源，为深入认识环状RNA的性质，揭开环状RNA的神秘面纱提供了全新的工具。

图3 TS circRNA组织表达丰度分析（来自(Xia et al., 2016)）

4. RBM20调控心肌中一类环状RNA的形成

8月16日，循环学顶级杂志Circulation Research杂志在线发表了一项重要的环状RNA研究最新成果，该论文的通讯作者是荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心的Esther E. Creemers教授和Yigal M. Pinto教授。本文介绍发现了扩张型心肌病重要的致病基因RBM20参与调控了Titin基因一类环状RNA形成的过程(Khan et al., 2016)。

RBM20是一种RNA结合蛋白，参与调控了众多心脏特异性的基因编辑过程。RBM20突变后常导致扩张型心肌病（DCM），结合最新的RNA剪接作用的新发现，尤其是由反向剪接作用形成环状RNA的相关研究报道的陆续出现，启发了作者提出了一个新的假设：RBM20突变或许会通过影响环状RNA的形成参与DCM疾病发生的过程！作者用肥厚型心肌病（HCM）和正常心肌作为对照，进行了环状RNA组学分析，在获得的circRNA数据中，发现有超过80种对应于Titin基因的环状RNA分子，其中22种为三组样本中均存在的。RYR2基因也发现了59种对应的环状RNA，其中16种在三组样本中均存在。Titin分子中存在一个I-band的区域，该区域是觉得肌节强度的重要位置，作者在所鉴定到的环状RNA中有一些是对应于这一区域的。之前已有报道表明RBM20参与了I-band区域相关的RNA剪接作用过程。RBM20突变会导致I-band区域剪接作用异常，影响Titin蛋白功能。于是作者就提出假设，是否在Titin对应的80种环状RNA所对应的内含子中会存在丰度更高的RBM20结合位点？结果证实了这一假设。80种环状RNA所对应的反向剪接内含子中RBM20结合位点的丰度大约是随机对照序列的5倍以上，而对应于所有826种环状RNA，RBM20结合位点的丰度大约是对照序列的2倍以上。作者构建了RBM20基因敲除小鼠进行验证。该小鼠模型具有典型的DCM特征，作者挑选了4条位于I-band区域的RBM20相关的环状RNA（mus_cTTN1-4）和2条位于N2A 和Z-disk区的不依赖RBM20的环状RNA（mus_cTTN5-6）进行半定量PCR分析表明RBM20敲除后无法形成mus_cTTN1-4却不影响mus_cTTN5-6。在RBM20敲除的小鼠中，原先对应于形成环状RNA的外显子更集中存在于线性的RNA中。作者推测可能是在Titin基因转录后的前体RNA中，这些外显子在RBM20的协助下从前体RNA分子中剪切下来，并进一步形成环状RNA，而当RBM20突变或敲除后，这些外显子序列无法正常剪切下来并形成环状RNA，最后积攒在线性的RNA分子中(Khan et al., 2016)。本文首次发现RBM20调控了一类环状RNA形成过程，或许为揭开扩张型心肌病致病机制提供了新的思路。
图4 Titin基因对应的环状RNA （来自(Khan et al., 2016)）

5. 一系列讨论环状RNA研究进展的重要综述文章：
5.1环状RNA作为一类非编码RNA在国际顶尖杂志Physiological Reviews的文章中进行了研究进展分析

8月17日，顶尖杂志生理学综述（Physiological Reviews，影响因子30.9）在线发表了德国汉诺威医学院分子和转化医学研究所Thomas Thum教授与英国伦敦帝国学院国家心肺研究所的同行共同署名发表的讨论非编码RNA与发育及疾病相关研究进展的重要综述文章(Beermann et al., 2016)。

文中作者系统分析了micro-RNA，lncRNA和circRNA在发育，疾病相关性及作为治疗靶点或工具的研究进展。作者把circRNA作为一大类非编码RNA进行了讨论，主要讨论了circRNA的形成机制，功能研究进展以及研究circRNA的工具与方法。在如此重要的综述性杂志中专门讨论circRNA的研究进展也足以说明环状RNA在RNA研究领域的分量。

5.2 环状RNA在神经系统疾病中的作用：

8月11日，Molecular Neurobiology杂志在线发表了康奈尔大学的Sun Tao教授为通讯作者的综述文章，介绍环状RNA在神经系统疾病中的研究进展(Floris et al., 2016)。

作者首先系统汇总了截至目前环状RNA的分类，形成机制与功能模型方面的研究进展情况，认为环状RNA的形成过程是受到一些条件控制的，并且存在组织特异性的特征，因此，环状RNA在生理和病理过程中非常可能有目前尚未发现的功能。在神经系统方面，大脑中异常高丰度的环状RNA也引起了作者的浓厚兴趣，一些已发表的文献均暗示环状RNA在神经系统中可能扮演特殊角色。小鼠和人类大脑中均发现了大量相对保守的，丰度高于所对应的线性RNA的环状RNA。有的环状RNA在神经发育过程中出现表达增高的情况，呈现明显的时空表达特性。突触结构中环状RNA的丰度更高。这些都不能用简单的基因加工副产物解释环状RNA在神经系统中的这些现象。环状RNA非常有可能有尚未知悉的重要生物学功能。疾病相关性研究的结果也表明环状RNA与AD，PD，ALS及精神分裂症有密切关系。例如miR-7在大脑皮层神经元祖细胞中丰度很高，ciRS-7作为著名的miR-7 sponge功能，其过表达与小头畸形有关，AD病人的海马区也观察到存在miR7-ciRS-7 互作异常的情况。AD病人中miR7-ciRS-7 互作异常还可能通过影响AD-淀粉样蛋白的清除作用关键蛋白UBE2A有关，这些现象都说明miR7-ciRS-7在AD发病机制中起重要作用。在PD中，miR7-ciRS-7可通过调控α-突触核蛋白的表达影响PD疾病进程。神经发育重要的调控基因如FBXW7、DOPEY2、RMST等都存在对应的环状RNA，这些环状RNA的表达与神经发育异常有一定的关系。一些ALS病人的胞质会出现RNA结合蛋白TDP-43富集的情况，如果胞质中富集ciRNA则能抑制TDP-43在胞质的富集和毒性作用，说明环状RNA还可以用于开发治疗神经系统疾病的药物。最后在抑郁症患者外周血单个核细胞中发现了特征性的环状RNA：hsa_circRNA_103636，该环状RNA表达降低与抑郁症的疾病进程有关(Floris et al., 2016)。

5.3环状RNA在神经系统发育过程中的作用：

8月26日，Frontiers in Molecular Neuroscience杂志在线发表了荷兰University Medical Center Utrecht的R. Jeroen Pasterkamp教授为通讯作者的综述文章，讨论了环状RNA在神经发育中的作用机制的相关研究进展情况（Dani?lle et al., 2016）。

文中作者共总结了11种环状RNA可能参与调控神经发育过程的机制模型：（1）竞争性结合micro RNA，例如CDR1as，SRY等环状RNA；（2）影响轴突生长和神经元迁移，例如体外过表达CDR1as会影响神经元迁移作用；（3）miR-671 可结合CDR1as并诱导AGO介导的降解CDR1as作用，释放所结合的micro RNAs；（4）通过RNA结合蛋白影响环状RNA的形成及竞争性结合RBP的作用，例如QKI，MBL或ADAR1调控的环状RNA形成过程，环状RNA竞争性结合TDP-43的作用等；（5）通过结合RBP促进后者的细胞定位变化，比如在神经突触中的定位；（6）环状RNA作为RBP蛋白形成复合物的脚手架，促进RBP的相互作用和形成更复杂的蛋白-RNA复合物；（7）EIciRNAs通过结合RNA聚合酶II促进所对应的基因的转录作用；（8）环状RNA直接表达多肽；（9）特定的环状RNA表达受到神经元状态的影响；（10）环状RNA定位于突触小泡结构中；（11）环状RNA定位于胞外膜结构中，可能参与远距离相互作用机制。以上总结的这些机制模型涵盖了绝大部分环状RNA研究的机制模型，它们均可能是环状RNA在神经系统中发挥作用的方式。

图5 环状RNA 在神经发育过程中可能的作用机制模型（来自（Dani?lle et al., 2016））

5.4环状RNA作为生物标志物的研究进展：

8月18日，Frontiers in Physiology杂志在线发表了马来西亚国民大学医学中心Nadiah Abu为通讯作者的综述性文章，汇总分析了环状RNA作为生物标志物的研究进展(Nadiah et al., 2016)。

作者从环状RNA功能研究进展入手，分析了环状RNA细胞类型相关的表达特异性特征，以及存在于外泌体等结构中的环状RNA的发现等等，都暗示了环状RNA作为生物标志物的可能性。最后，作者总结了目前已报道的可以作为疾病相关的生物标志物的环状RNA分子，总结如下图。

图6可作为生物标志物的环状RNA （来自(Nadiah et al., 2016)）

5.5环状RNA生物学作用研究汇总：

8月11日，RNA Biology杂志在线发表了第四军医大学李海民教授为通讯作者的综述文章，汇总分析了环状RNA可能参与的生理病理活动过程(Shibin et al., 2016)。著名的RNA研究大师J?rgenKjems教授作为本文的并列作者之一。

文中作者系统分析了目前已知的有特征性环状RNA报道的事例，汇总形成了如下表格。表中整理的环状RNA均有报道参与调控重要生物学过程，对于开展环状RNA相关研究有重要借鉴意义。

图7有重要生物学作用的环状RNA （来自(Shibin et al., 2016)）

5.6早期环状RNA研究对RNA剪接机制认识的贡献：

8月27日，RNA Biology杂志在线发表了伊利诺伊大学化学系Zvi Pasman教授与德克萨斯大学医学部，杜克-新加坡国立大学医学院的Mariano A. Garcia-Blanco教授联合撰写的综述文章，讨论了早期关于环状RNA形成机制的研究对于人类认识RNA剪接作用过程的贡献(Pasman and Garcia-Blanco, 2016)。

早期的研究中通过构建置换的I类内含子拼接位点，成功观察到了环状RNA的形成。这一工具有效的阐明了具有自我剪接作用的I类内含子如何实现剪接作用的机制的问题，也为II类内含子剪接作用的研究提供了有力的研究工具。一项研究发现酵母和人类细胞核提取物可实现单个外显子的环化剪接作用过程，不同的是，酵母在该过程中只产生剪接产物形式，而人类中则会出现非目标剪接形式的中间产物，具体机制目前依然不清楚。早期的环状RNA研究大大提高了对RNA前体剪接加工作用机制的认识(Pasman and Garcia-Blanco, 2016)。

5.7胃癌中非编码RNA的情况

8月7日，World J Gastroenterol杂志在线发表了复旦大学医学院杜详教授为通讯作者的综述文章，探讨了非编码RNA在胃癌中的作用机制相关研究进展，其中讨论到了环状RNA(Zhang and Du, 2016)。

作者分别汇总分析了各类非编码RNA在胃癌中的研究情况，相关信息汇总如下图。其中环状RNA：Hsa_circ_002059和circ-ITCH在胃癌中表现为下调，而circ-Foxo3表现为上调(Zhang and Du, 2016)。

图8胃癌中已发现的非编码RNA汇总（来自(Zhang and Du, 2016)）

6. 其他环状RNA研究进展：
6.1小鼠睾丸组织转录组学研究表明环状RNA在睾丸组织中有特殊作用：

8月25日，RNA Biology杂志在线发表了中科院动物研究所韩春生教授为通讯作者的研究论文，介绍他们系统分析睾丸组织中转录组学的研究成果，其中讨论了环状RNA的表达情况(Lin et al., 2016)。

后生动物的所有组织中，睾丸组织是多样性程度最高的，与精子发生有关的成分和动力学变化过程一直没有系统的研究。本文基于二代测序技术系统分析了小鼠精子发生过程相关的20639种mRNA，7168种lncRNAs以及15101种环状RNAi，其中很多是睾丸组织特异性的表达产物。LncRNAs比mRNA在睾丸组织中的特异性更强，在所有阶段，mRNA的通常比lncRNAs更丰富，线性RNA比环状RNA更丰富。其中的环状RNA和piRNA的表达是受到严格调控的，不仅仅是随机产生的。在体外培养的精原干细胞中，我们通过功能筛选实验证明一些lncRNAs与精子发生过程密切相关。一些特征性mRNA和环状RNA的启动子区发现了存在精子发生相关重要转录因子结合元件。作者还进一步分析了精子发生过程重要的调控性转录因子CREM和RFX2在基因组中结合的情况。本文的研究结果为提高精子发生机制的认识提供了重要的信息资源(Lin et al., 2016)。

图9精子发生过程中相关的环状RNA （来自(Lin et al., 2016)）

6.2植物circRNA研究工具软件：

8月20日，Bioinformatics杂志在线发表了浙江大学樊龙江教授团队的文章，介绍开发了一种专门用于植物中分析环状RNA的软件工具：PcircRNA_finder。该软件在分析植物来源的circRNA方面比传统的find_circ及CIRCexplorer更灵敏(Chen et al., 2016)。

6.3环状RNA预测和分类的理论模型

8月25日，IEEE Xplore Digital Library发表了印度Allahabad信息技术研究所Rajnish Kumar，Tapobrata Lahiri和Gautam Kumar共同署名的一项研究报告，报道发明了一种新的环状RNA De Novo组装技术，该技术不需要将Reads mapping至参考基因组序列，也无需预测环化位点。该技术通过模拟环化后序列排列的情况进行环状RNA的预测。

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