十月份环状RNA研究汇总
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在刚刚结束的10月份，环状RNA依然受到国内外同行的高度关注，也有一些重要的研究成果报道。常规的基于高通量测序的组学分析的报道依然持续。从特定基因入手，分析特定基因所对应的环状RNA的形成机制和作用机制的报道成为本月环状RNA研究报道的一个新特点，比如Charles Gawad教授借助单细胞测序探讨ASXL1基因对应的环状RNA形成机制的问题(Koh et al., 2016)。Hitoshi Suzuki教授探索的DMD相关外显子可变剪接和环状RNA形成机制的研究(Suzuki et al., 2016)。这说明与特定基因对应的环状RNA相关的研究已在一些同行的课题组中悄然展开。下面就让我们一起梳理一下10月份环状RNA领域的主要进展吧。
10月11日，Nature出版集团子刊Scientific Reports在线发表了南京医科大学Li Yan团队的一项重要环状RNA研究成果，介绍开发了首个汇总可编码蛋白的环状RNA的数据库：circRNADb(Chen et al., 2016b)。（数据库网址：http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb）
文中作者通过汇总整理，共收集了32914条人类外显子环状RNA记录，每条记录都包括基因组位置信息，RNA编辑情况，所对应的基因组序列，IRES序列元件，预测的ORF以及相关的参考文献。作者发现了有16328条环状RNA包含了编码超过100个氨基酸的ORF，其中7170种环状RNA存在IRES序列元件，基本符合翻译蛋白的特征(Chen et al., 2016b)。
图1 circRNADb数据库首页
10月14日，Nature Reviews Genetics杂志在线发表了斯坦福大学斯坦福癌症研究中心的Julia Salzman教授为通讯作者的综述文章，汇总分析了环状RNA研究方法的现状和主要问题(Szabo and Salzman, 2016)。
作者在这篇综述中详细讨论了目前在环状RNA分析方面所遇到的各种技术问题，包括样品制备和数据分析等方面。系统归纳剖析后，作者认为基于分离Poly(A)-(+)RNA进行环状RNA假阳性甄别的实验更可取，原因有两个：
1. 从已知的实验结果来看，进行Poly(A)-(+)RNA的过程所得到的Poly(A)-(+)RNA中只有极少量的环状RNA，但RNase R消化却可以导致一些已经被证实的环状RNA被降解，比如CDR1as。
2. 在分离后的Poly(A)-(+)RNA中分析得到的丰度较高的“环状RNA”很多被证实是由基因重复序列导致的数据分析假阳性结果。因此，综合而言，分离Poly(A)-(+)RNA和Poly(A)-(-)RNA进行环状RNA假阳性甄别是比RNase R消化更有效的方法(Szabo and Salzman, 2016)。
图1常用的环状RNA分析校准方法优势与不足分析 （来自(Szabo and Salzman, 2016)）
10月13日，PloS One 杂志在线发表了圣犹达儿童医院的Charles Gawad教授团队的最新研究成果，探索了ASXL1基因所对应的环状RNA的动态形成机制(Koh et al., 2016)。
ASXL1是PolyComb家族的一个基因，突变后常导致髓系白血病。CircBase数据库中可检索到该基因对应的环状RNA。本文作者首先利用反转录实验鉴定数据库所描述的环状RNA，意外的发现了存在内含子3的一种环状RNA特异的可变剪接形式。接着通过构建与短型（short linear RNA isoform ）序列一致的表达载体模拟RNA前体转录和加工过程。证明了该基因的环状RNA形成过程既需要正确的转录起始也需要中间的反向Alu元件。有趣的是，在这种过表达的细胞体系中进行常规RNA Seq分析，排除了实验过程和分析的假性结果的可能后，作者意外的发现了外显子之间都或多或少的存在拼接产物，预示着RNA过表达后存在多样化的动态拼接作用过程。最后作者借助单细胞测序技术分析了不同细胞中各种可变剪接的存在情况，表明在不同细胞中RNA线性和环状产物拼接的情况呈现高度的异质性特征(Koh et al., 2016)。本文的围绕具体的基因所对应的环状RNA形成机制进行研究，借助构建的载体进行灵活的基因序列筛查，并将单细胞测序技术引入环状RNA的研究中。本文的思路构架和技术体系为针对特定基因进行环状RNA形成机制的研究提供了很好的借鉴。
图2 ASXL1基因的外显子拼接作用在单细胞中呈现高度异质性（来自(Koh et al., 2016)）
10月18日，Scientific Reports杂志在线发表了南京医科大学附属肿瘤医院Yin Rong教授及其团队的一项研究成果，发现环状RNA has_circ_0067934在食管鳞状细胞癌中上调并促进细胞增殖(Xia et al., 2016)。
作者共分析了51例不同分级状态的食管鳞状细胞癌病人标本，发现环状RNA has_circ_0067934在肿瘤组织中表达量明显高于癌旁组织，并且has_circ_0067934的高表达与肿瘤分期有很强的相关性，分期越高的表达也越高。体外实验中表明干扰has_circ_0067934可明显抑制细胞增殖并导致细胞周期阻滞。基于分离实验和荧光原位杂交试验证明该环状RNA主要定位于细胞质中(Xia et al., 2016)。
图3 has_circ_0067934的高表达与肿瘤分期相关 （来自(Xia et al., 2016)）
10月底，J Neurochem杂志在线发表了新南威尔士大学Michael Janitz教授和他的团队的一项研究成果，探讨了多系统萎缩症（multiple system atrophy，MSA）患者大脑组织中环状RNA的表达情况(Chen et al., 2016a)。
作者分别分析了6例MSA和6例健康对照组的灰质和白质组织中的环状RNA表达情况。最终发现IQCK, MAP4K3, EFCAB11, DTNA和 MCTP1这5种环状RNA特异性的在MSA患者的额叶皮层中高表达，而所对应的线性RNA的表达并没有显著的改变(Chen et al., 2016a)。
图4 MSA病人额叶皮层中五种环状RNA高表达 （来自(Chen et al., 2016a)）
10月14日，帕多瓦大学妇女儿童健康系G te Kronnie教授为通讯作者在Blood Cancer Journal杂志在线发表了一篇综述文章，系统汇总分析了造血系统及血液系统肿瘤相关的环状RNA研究进展(Bonizzato et al., 2016)。
文中作者首先介绍了环状RNA检测技术，形成机制及主要的功能模型。然后针对造血系统和血液系统肿瘤，主要介绍了血液肿瘤，健康外周血及血小板中已报道的一些环状RNA筛选鉴定工作。重点介绍了经常导致血液系统肿瘤的染色体易位突变引入的融合性环状RNA（f-circRNAs）在血液系统肿瘤中的作用。总体而言，作者认为，根据现有的文献报道，鉴定到的环状RNA表现出一定的组织和细胞类型特异性特征，所对应的基因与细胞增殖，凋亡等信号通路关系密切，因此深入探索环状RNA在血液系统发育和肿瘤发生发展中的作用是非常重要的科学问题(Bonizzato et al., 2016)。
图5 染色体易位形成的环状RNA也能起到类癌基因的作用 （来自(Bonizzato et al., 2016)）
10月13日，International Journal of Molecular Sciences杂志在线发表了日本先进科学研究所的Hitoshi Suzuki教授和他的团队的一项研究成果，报道杜氏肌营养不良突变热点位点存在RNA拼接多态性，也存在反向拼接的环状RNA(Suzuki et al., 2016)。
杜氏肌营养不良（DMD）是一类严重的骨骼肌系统疾病，有报道表明DMD基因的外显子45-55区跳跃拼接（multiple exon skipping，MES)后可能对DMD病情控制有帮助。作者通过构建DMD基因44-56外显子区对应的基因组序列表达载体，分析了其中RNA剪接作用情况。作者共发现了8种不同的外显子跳跃拼接产物。作者还发现上游内含子可以作为远端拼接的供体与下游条与拼接位点内含子发生互作，进而形成跳跃拼接的产物。在该位点，作者也坚定到了反向拼接的情形，因此也可形成环状RNA(Suzuki et al., 2016)。
图6 MDM基因突变热点反向拼接形成环状RNA （来自(Suzuki et al., 2016)）
10月14日，RNA Biology杂志在线发表了浙江大学Ye Chu-Yu和中国农业科学院水稻研究所Guo Longbiao共同通讯作者的研究成果，发现在水稻中存在不依赖GT/AG规则拼接形成的环状RNA(Ye et al., 2016)。
文中作者巧妙的利用分析过程中筛选到的覆盖反向拼接位点的双尾测序Reads分析所涉及的环状RNA的序列特征。作者在去除核糖体RNA和RNase R消化后的RNA样品测序结果中共鉴定到大约3000个左右的环状RNA，分析这些环状RNA的序列特征的时候，作者意外的发现了在水稻中存在一大类不符合GT/AG拼接规则的RNA拼接产物(Ye et al., 2016)。这类拼接作用在上个月的另一个拟南芥的研究报道中也发现过，但目前这类奇特的现象还仅限于植物来源的样本，哺乳动物中暂未发现。具体机制还有待进一步探索。
图7 水稻中存在一大类非GT/AG规则拼接的环状RNA （来自(Ye et al., 2016)）
陈玲玲课题组发现新型lncRNA
10月27日，知名杂志Molecular Cell在线发表了陈玲玲课题组的一项重要研究成果，报道发现了一种新型的RNA转录加工产物：SPA及其分子机制。SPA是一种新型的lncRNA，它的5’端为snoRNA，3’端为Poly(A)(Huang Wu et al. 2016)。文中系统分析了SPA形成机制，分子细胞生物学作用机制并探讨了PWS病人中SPA如何发挥作用的。
本文虽不是直接研究环状RNA的，但所采用的实验技术以及本文所得出的结论都对环状RNA的研究有非常大的参考价值。本文从RIP实验入手发现了奇怪的RNA分子：SPA，接着分别探索了SPA的形成机制和细胞定位，也做了敲除实验，系统分析其分子作用机制。借助RNA Pull-down实验筛选到了SPA相互作用的蛋白分子，并结合敲除体系，最终揭示了完整的故事。由此不难看出，筛选鉴定相互作用分子的技术体系在RNA研究中具有特别重要的价值！将RIP和RNA Pull-down以及iCLIP等RNA相互作用分析技术灵活运用是RNA研究的重要工具，非常值得大家学习借鉴。此外，在环状RNA加工的过程中是否也存在类似SPA的转录调控机制也值得思考。
10月13日，Gene杂志在线发表了中国林业科学院Zhang Jianguo和He Caiyun共同通讯作者的文章，介绍分析了沙棘果中lncRNA和环状RNA测序的研究结果。作者在成熟果实中共鉴定到3428种lncRNA分别在红色和黄色果实中鉴定到3819 和2295种环状RNA。该研究结果丰富了环状RNA和lncRNA研究的物种信息(Ye et al., 2016)。
10月的肿瘤防治研究杂志发表了南京医科大学附属淮安第一医院郭佳妮撰写的综述文章，介绍了环状RNA在肿瘤研究中的主要进展（郭佳妮，2016）。
10月期的Journal of the American College of Cardiology杂志发表了西安交通大学第一附属医院的Deng Yang-Yang等撰写的研究摘要，介绍在人类急性心肌梗死病人中，PPAR相关的circRNA起到ceRNA的作用。在这项工作中，作者共鉴定到7326种环状RNA，其中160种存在差异性表达。其中circRNA_081881包含了7个不同的miR-548竞争性结合位点，miR-548与PPAR相关（Yang-Yang Deng, 2016）。
总之，刚刚结束的10月份里环状RNA持续受到国内外相关同行的高度关注，研究方向也出现了较为明显的变化，传统的组学筛选鉴定依然持续进行，针对特定基因分析所对应的环状RNA形成机制和作用机制的研究报道已开始出现，相信着也将成为未来非常重要的研究方向。
参考文献：
Bonizzato, A., Gaffo, E., Te Kronnie, G., and Bortoluzzi, S. (2016). CircRNAs in hematopoiesis and hematological malignancies. Blood cancer journal 6, e483.
Chen, B.J., Mills, J.D., Takenaka, K., Bliim, N., Halliday, G.M., and Janitz, M. (2016a). Characterization of circular RNAs landscape in multiple system atrophy brain. Journal of neurochemistry 139, 485-496.
Chen, X., Han, P., Zhou, T., Guo, X., Song, X., and Li, Y. (2016b). circRNADb: A comprehensive database for human circular RNAs with protein-coding annotations. Sci Rep 6, 34985.
Koh, W., Gonzalez, V., Natarajan, S., Carter, R., Brown, P.O., and Gawad, C. (2016). Dynamic ASXL1 Exon Skipping and Alternative Circular Splicing in Single Human Cells. PloS one 11, e0164085.
Suzuki, H., Aoki, Y., Kameyama, T., Saito, T., Masuda, S., Tanihata, J., Nagata, T., Mayeda, A., Takeda, S., and Tsukahara, T. (2016). Endogenous Multiple Exon Skipping and Back-Splicing at the DMD Mutation Hotspot. International journal of molecular sciences 17.
Szabo, L., and Salzman, J. (2016). Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nat Rev Genet 17, 679-692.
Xia, W., Qiu, M., Chen, R., Wang, S., Leng, X., Wang, J., Xu, Y., Hu, J., Dong, G., Xu, P.L., et al. (2016). Circular RNA has_circ_0067934 is upregulated in esophageal squamous cell carcinoma and promoted proliferation. Sci Rep 6, 35576.
Ye, C.Y., Zhang, X., Chu, Q., Liu, C., Yu, Y., Jiang, W., Zhu, Q.H., Fan, L., and Guo, L. (2016). Full-length sequence assembly reveals circular RNAs with diverse non-GT/AG splicing signals in rice. RNA biology, 0.
郭佳妮. circRNAs在肿瘤中的研究进展. 肿瘤防治研究2016年第43卷第8期
Yang-Yang Deng, Weiping Zhang, Jianqing She, Lisa Zhang, Tao Chen, Juan Zhou, Zuyi Yuan. Circular RNA Related to PPAR Function as ceRNA of microRNA in Human Acute Myocardial Infarction. J Am Coll Cardiol. 2016;68(16_S):C51-C52. doi:10.1016/j.jacc.2016.07.189